泮俊 裘濤 楊峰 鄒瑩 陶水良?

重癥肌無(wú)力（Myasthenia gravis，MG）指主要由乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體參與、主要累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜乙酰膽堿受體的獲得性自身免疫性疾?。?］。目前西醫(yī)治療主要有膽堿酯酶抑制劑、免疫抑制劑治療、靜脈注射丙種球蛋白、血漿置換、胸腺切除等。這些治療方法效果均不理想。經(jīng)作者臨床應(yīng)用，認(rèn)為馬錢子治療MG有確切療效［2］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)EAMG大鼠IL-4、IL-6的表達(dá)，初步揭示炙馬錢子對(duì)MG免疫機(jī)制的影響，為炙馬錢子治療MG提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動(dòng)物：SPF級(jí)8周齡Lewis大鼠50只，雌性，體質(zhì)量220～260g（浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。（2）主要藥物：炙馬錢子膠囊（200mg/粒，浙江省中醫(yī)院中藥制劑室）；新斯的明注射液（上海信誼金朱有限公司）；阿托品注射液（0.5mg/支，浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司）；強(qiáng)的松片（5mg/片，浙江仙琚制藥股份有限公司），實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.2%的梭甲基纖維素鈉將其配制成所需濃度的混懸液。（3）主要試劑：鼠源性AChR-a亞基97-116肽段序列（the rat sequence 97-116 of the AChR a subunit，R97-116）、完全福氏佐劑（CFA）、磷酸緩沖液（PBS），大鼠IL-6、TGF-β1、AChRab ELISA檢測(cè)試劑盒。

1.2 方法 （1）EAMG動(dòng)物模型建立：本實(shí)驗(yàn)參考Tihamer等［3］和許文華等［4］的模型制備法復(fù)制EAMG實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。將R97-116、CFA、PBS三者按1：1.5：1.5的比例充分混勻制成免疫乳劑；首次免疫：取乳劑200μl（含R97-116：100μg）于造模鼠足墊、腹部、背部多點(diǎn)皮下注射，正常對(duì)照組（A組）皮下注射等量PBS；首次免疫后第30天及第45天，取乳劑200μl（含R97-116：50μg）強(qiáng)化接種，A組注射等量PBS。（2）模型評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：①臨床評(píng)估：通過(guò)測(cè)量體重和肌力評(píng)價(jià)疾病嚴(yán)重性。實(shí)驗(yàn)前及接種后2次/周稱重，末次免疫2周后觀察其攝食、姿勢(shì)及活動(dòng)情況。測(cè)量肌力（即讓鼠重復(fù)抓握籠頂30s再測(cè)量）采用Berman等［5］的分級(jí)法予以臨床評(píng)分，肌力具體分級(jí)為：0級(jí)，無(wú)肯定的肌無(wú)力表現(xiàn)；1級(jí)，撕咬無(wú)力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活動(dòng)減少且易疲勞；2級(jí)，明顯無(wú)力，在抓握前就出現(xiàn)震顫、低頭、隆背，抓握力弱；3級(jí)，在抓握前即有嚴(yán)重的肌無(wú)力表現(xiàn)，無(wú)力抓握，頻死狀態(tài)；4級(jí)，死亡。②新斯的明試驗(yàn)：用腹腔注射法給予新斯的明（37.5μg/kg）和硫酸阿托品（15μg/kg），12min后大鼠肌無(wú)力癥狀可緩解，持續(xù)2～12h。（3）實(shí)驗(yàn)分組：從50只大鼠中隨機(jī)取6只為正常組（A組），剩余進(jìn)行EAMG造模。實(shí)驗(yàn)大鼠約于第2次注射后2周左右大鼠陸續(xù)發(fā)病，分別對(duì)大鼠進(jìn)行模型及臨床評(píng)估后，將建模成功的大鼠依據(jù)模型評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)均衡隨機(jī)分為模型組（B組）、陽(yáng)性藥物組（C組）、炙馬錢子低劑量組（D組）、炙馬錢子中劑量組（E組）、炙馬錢子高劑量組（F組）各6只，分籠喂養(yǎng)（自由飲水、攝食）。（4）給藥劑量與方法：根據(jù)裘昌林［6］在人體中馬錢子的用量及動(dòng)物與人藥物劑量的換算公式，分別予以灌胃給藥，1次/d，炙馬錢子低、中、高劑量組分別以 75mg/（kg·d）、150mg/（kg·d）、225mg/（kg·d）的劑量灌胃治療，1次/d；陽(yáng)性藥物對(duì)照組以強(qiáng)的松4mg/（kg·d）的劑量灌胃治療，1次/d；正常組、模型組稱重后給予藥液等量的蒸餾水灌胃，共治療28d。（5）檢測(cè)項(xiàng)目及方法：A、B、C、D、E、F各組治療28d后，禁食12h；采用眼球取血法取靜脈血1.5ml，靜置30min后，3000r/min，離心10min，取上層血清，放置-20℃冷凍保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分別檢測(cè)細(xì)胞免疫指標(biāo)IL-4、IL-6。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示；對(duì)于總體分布不明的小樣本資料，各組間結(jié)果比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布且方差齊性用單因素方差分析，樣本率的比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模前后大鼠肌無(wú)力癥狀陽(yáng)性率比較 按照Lennon評(píng)分法對(duì)末次免疫2周后的EAMG大鼠模型進(jìn)行臨床表現(xiàn)評(píng)估，結(jié)果顯示，造模后全部大鼠新斯的明試驗(yàn)陽(yáng)性，Lennon臨床評(píng)分0.5～2級(jí)，取評(píng)分≥1級(jí)為肌無(wú)力陽(yáng)性，其中1級(jí)大鼠26只，2級(jí)大鼠9只，造模前后大鼠肌無(wú)力陽(yáng)性率與造模前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 造模前后大鼠肌無(wú)力癥狀陽(yáng)性率比較［n（%）］

2.2 大鼠一般情況觀察 造模第1周，除正常對(duì)照組外，其余大鼠出現(xiàn)短暫性肌無(wú)力癥狀，其臨床癥狀未經(jīng)治療可自行緩解；第二次免疫后，大鼠出現(xiàn)進(jìn)食減少，精神萎靡，活動(dòng)減少等表現(xiàn)，但肌無(wú)力表現(xiàn)不典型；追加免疫后，大鼠叫聲低弱，對(duì)環(huán)境刺激反應(yīng)遲鈍，少動(dòng)，毛發(fā)干枯，撕咬無(wú)力且易疲勞，蜷縮拱背，四肢肌無(wú)力表現(xiàn)比較典型，但無(wú)呼吸困難，脫水等危重表現(xiàn)。炙馬錢子高劑量組有1只大鼠死亡，最后確定送檢標(biāo)本為A～E各組6只，F(xiàn)組5只。

2.3 各組大鼠體質(zhì)量變化情況 見(jiàn)表2。

表2 各組EAMG大鼠治療前后體質(zhì)量變化差值水平比較［g，（x±s）］

2.4 各組EAMG大鼠血清中IL-4、IL-6含量比較 見(jiàn)表3。

表3 各組EAMG大鼠血清IL-4、IL-6含量的比較［pg/ml，（x±s）］

3 討論

MG是一種獲得性自身免疫性疾病，但MG確切的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明確。研究表明，其可能是一種由多基因調(diào)控、多種機(jī)制參與的復(fù)雜性疾?。?］。MG的發(fā)生與發(fā)展涉及多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子，其與抗AChR CD4+T細(xì)胞的活化，及與B細(xì)胞相互作用產(chǎn)生高親和力的特異性AChR抗體密切相關(guān)。根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同，CD4+T 細(xì)胞可分為不同的亞型，其中輔助T細(xì)胞（Th1）以分泌白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）為主，促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6 和IL-10，促進(jìn)體液免疫反應(yīng)；而Th3細(xì)胞則主要分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），參與免疫抑制機(jī)制。特異性AChR抗體通過(guò)激活補(bǔ)體系統(tǒng)、促進(jìn)AChR降解，及AChR功能阻滯等機(jī)制損害神經(jīng)肌肉接頭的結(jié)構(gòu)與功能。某些細(xì)胞因子水平的變化有助于判斷疾病的嚴(yán)重程度、治療效果和預(yù)后，甚至可能找到MG治療的新方法，應(yīng)用人工干預(yù)以提高某些免疫抑制性細(xì)胞因子水平或降低某些促炎性細(xì)胞因子水平，可能為MG的治療提供新的方向。

Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-6、等抗炎細(xì)胞因子，主要刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體，與體液免疫應(yīng)答相關(guān)［8］；IL-4為Th2的特征性細(xì)胞因子，主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，可以促進(jìn)B細(xì)胞增殖，使B細(xì)胞提呈抗原能力增強(qiáng)，提高巨噬細(xì)胞提呈抗原的能力，使其具有殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。目前IL-4在MG的發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚，不同的研究報(bào)道有不同的觀點(diǎn)。有研究［9］發(fā)現(xiàn)MuSK免疫的小鼠中IL-4水平顯著升高，并進(jìn)一步促使抗MuSK抗體滴度升高，從而加重EAMG的癥狀。本資料中發(fā)現(xiàn)經(jīng)免疫接種后的模型大鼠血清中IL-4含量較空白對(duì)照組有明顯上升，經(jīng)藥物治療后其含量有不同程度的下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），尤其予炙馬錢子治療組血清IL-4樣品濃度水平明顯降低，其中中、高劑量組較強(qiáng)的松治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明炙馬錢子可能通過(guò)IL-4下調(diào)作用起到改善重癥肌無(wú)力癥狀的作用。

IL-6由Th2等多種細(xì)胞分泌，B細(xì)胞終末分化并分泌抗體的必需因子。IL-6還可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化、增殖和分化，促進(jìn)T細(xì)胞表達(dá)IL-2R和IL-2［10］。IL-6受體廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞，作為參與免疫應(yīng)答的重要炎癥介質(zhì)，在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮多種效應(yīng)。較多疾病中均有IL-6的異常分泌，尤其是一些自身免疫性疾病，IL-6在其中起到誘發(fā)和維持免疫炎性反應(yīng)的功能。研究表明，MG患者血清IL-6水平顯著高于對(duì)照組，且MG癥狀改善者其血清IL-6水平也明顯下降，表明IL-6在MG發(fā)病中起促進(jìn)作用。用AChR進(jìn)行免疫，發(fā)現(xiàn)IL-6基因缺乏鼠發(fā)生EAMG的比例明顯低于野型鼠［11］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EAMG模型鼠血清中IL-6含量相比正常組顯著升高（P＜0.01），這與大多數(shù)文獻(xiàn)結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)藥物治療后IL-6含量出現(xiàn)不同程度的下降，表明炙馬錢子和強(qiáng)的松對(duì)降低EAMG大鼠血清中IL-6含量均有明確療效，其中炙馬錢子中、高劑量組比強(qiáng)的松組含量更低（P＜0.01），表明中、高劑量的炙馬錢子在降低IL-6含量方面治療效果優(yōu)于強(qiáng)的松。

馬錢子是毒藥，且治療量與中毒量非常接近。盡管在制備過(guò)程中使用浸泡、油炒等工序其目的是為了降低藥物的毒性［12］，但藥物本身超過(guò)一定劑量依然可導(dǎo)致藥物中毒。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，炙馬錢子高劑量組有大鼠在連續(xù)給藥過(guò)程中死亡，原因可能就與藥物濃度過(guò)高有關(guān)。因此，采用炙馬錢子治療重癥肌無(wú)力時(shí)，劑量的判定非常重要，一定范圍內(nèi)的高劑量藥物，能夠加強(qiáng)治療效果；反之，毒副作用也相應(yīng)增加。裘昌林［13］認(rèn)為馬錢子性雖有毒，但只要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格炮制、合理地用藥，中毒完全可以避免，并總結(jié)出“小劑量漸加量法；分次服用，單劑量不＞0.4g；觀察藥物有效反應(yīng)，適時(shí)調(diào)整劑量”的用藥經(jīng)驗(yàn)。

綜上所述，炙馬錢子能一定程度的降低EAMG大鼠血清中IL-4和IL-6含量，緩解EAMG的病情，其作用機(jī)制和強(qiáng)的松相似，屬于通過(guò)抑制免疫活化而達(dá)到治療效果，且一定劑量范圍內(nèi)的炙馬錢子在免疫調(diào)節(jié)方面的表現(xiàn)優(yōu)于強(qiáng)的松。

［1］ 重癥肌無(wú)力診斷和治療中國(guó)專家共識(shí).中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2012,19(6):401-408.

［2］ 裘濤,陳眉.炙馬錢子膠囊治療重癥肌無(wú)力31例臨床觀察.中國(guó)中醫(yī)藥科技,2008,15(3):219-220.

［3］ Tihamer Orban, Peter Blackburn. Methods for treating autoimmune disease by inducing autoantigen-specific regulatory CD4+ T cells:US,2009.

［4］ 許文華,韓瑩瑩,汪思應(yīng),等.鼠源乙酰膽堿受體α亞基97-116肽段免疫Lewis鼠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性重癥肌無(wú)力模型.中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志,2006,32(2):179-180.

［5］ Berman PW. Experimental Myasthenia Gravis:A Murine System Exp.Med,1980,151:204.

［6］ 裘昌林.馬錢子治療重癥肌無(wú)力8例.浙江中醫(yī)雜志,1986,31(1):27.

［7］ Conti-Fine BM,Milani M,Kaminski HJ.Myasthenia gravis: past,present,and future.Clin Invest,2006,116:2843-2854.

［8］ Jutel M,Akdis CA. T-cell subset regulation in atopy. Curr Allergy Asthma Rep,2011,11:139-145.

［9］ Ulusoy C, Kim E, Tuzun E, et al. Preferential production of IgG1,IL-4 and IL-10 in MuSK- immuni zedmice. Cl in Immunol,2014, 151:155-163.

［10］ La Flamme AC,Pearce EJ. The absence of IL-6 does not affect Th2 cell development in vivo,but does lead to impaired proliferation,IL-2 receptor expression,and B cell responses. J Immunol, 1999,162:5829-5837.

［11］ Deng C,Goluszko Z,Tuzun E,et al.Resistance to experimental autoimmune myasthenia gravis in IL-6 deficient mice is associated with reduced germinal center formation and C3 production.Immunol, 2002,15:1077.

［12］ 錢松祥.813膠囊的制備及臨床應(yīng)用.中國(guó)中醫(yī)藥科技,2006,13(5):347.

［13］ 裘昌林,金香鸞.馬錢子治療重癥肌無(wú)力出現(xiàn)毒性反應(yīng)及預(yù)防措施的探討.中國(guó)現(xiàn)代藥學(xué)應(yīng)用雜志,1998,15(2):35.