韓春然，張家成，王 鑫，那治國(guó)，2，王佳寧，謝靜南，張 凱

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150076；2.黑龍江東方學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150066）

藍(lán)靛果忍冬（Lonicera enulis Turcz） 簡(jiǎn)稱藍(lán)靛果，屬被子植物門(mén)，忍冬科，忍冬屬。藍(lán)靛果原產(chǎn)于北半球溫帶地區(qū)，隨后被引入世界各國(guó)種植培育，如今在中國(guó)、俄羅斯、日本及朝鮮等絕大多數(shù)亞歐地區(qū)都有藍(lán)靛果的種植與開(kāi)發(fā)。我國(guó)對(duì)藍(lán)靛果的研究相對(duì)其他發(fā)達(dá)國(guó)家起步晚。起初，我國(guó)主要致力于研究關(guān)于野生藍(lán)靛果的資源調(diào)查和人工栽培這2個(gè)方面；近年來(lái)，隨著對(duì)野生藍(lán)靛果開(kāi)發(fā)利用的研究逐漸深入，在生態(tài)學(xué)特性、器官解剖、分類、地位等一系列研究上，我國(guó)學(xué)者取得了較大進(jìn)展。藍(lán)靛果果實(shí)不僅富含礦物質(zhì)、各類氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且還含有大量的花色苷、黃酮、多酚等對(duì)人體有益的活性物質(zhì)[1-5]。這些物質(zhì)都對(duì)人體健康具有促進(jìn)作用，使藍(lán)靛果具有較高的藥用功能和保健價(jià)值[6-8]。

張雁南等人[9]的研究發(fā)現(xiàn)微波輔助提取法中，體積分?jǐn)?shù)為65%無(wú)水乙醇提取出的藍(lán)靛果紅色素可以清除自由基，從而起到抗氧化作用。王恩福等人[10]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)注射高脂食物使大鼠患有試驗(yàn)型高血脂，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯所提取的藍(lán)靛果提取物可以使大鼠體內(nèi)密度脂蛋白和血清中超氧化物歧化酶的含量增加，而甘油三酯和血清中丙二醛的含量明顯減少，表明該物質(zhì)對(duì)高脂大鼠具有一定的降脂功效。劉奕琳等人[11]采用細(xì)胞凋亡的試驗(yàn)研究表明，藍(lán)靛果花色苷在一定條件下對(duì)人體肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞均有很強(qiáng)的抑制作用，其安全無(wú)毒和極佳的生理功效，已經(jīng)使多糖成為一類具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的新型藥物資源[12]。一系列的研究表明，多糖具有提高機(jī)體免疫力、預(yù)防疲勞、降血糖、降血脂、抗癌、抑菌、防輻射等生理功效[13]。現(xiàn)階段，大量的動(dòng)植物多糖已經(jīng)被成功開(kāi)發(fā)利用，如大棗、南瓜多糖[14-15]、殼聚糖等。藍(lán)靛果中含有較為豐富的多糖，是一種良好的提取原料。目前，對(duì)藍(lán)靛果的研究集中在花色苷的提取、純化及功能性研究，對(duì)藍(lán)靛果多糖的研究還是空白。所以，優(yōu)化藍(lán)靛果多糖的提取工藝，對(duì)深入研究其功能性及系列產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

1 試驗(yàn)部分

1.1 原料與試劑

藍(lán)靛果，黑龍江勃利縣采摘；硫酸、苯酚、乙醇，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司提供；快流速DEAE-瓊脂糖凝膠，北京博奧拓達(dá)科技有限公司提供。

KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；UV-9100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品；HL-2B型數(shù)顯恒流泵，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品250 mg置于250 mL的容量瓶中，加水適量使其溶解、定容。精密吸取上述溶液25 mL，定容至250mL容量瓶中，即得100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品。用移液槍精密移取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于試管中，定容至1 mL，分別加1.0 mL的6%苯酚，搖勻迅速滴加濃硫酸5mL，搖勻，在室溫下冷卻30 min，以空白校正零點(diǎn)。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定

吸取提取出的樣品溶液，根據(jù)上述操作，測(cè)定樣品溶液的吸光度，將其帶入回歸方程，以計(jì)算多糖的含量。公式如下：

式中：C——樣液的濃度；

V——定容后的體積；

0.934——藍(lán)靛果多糖/總糖轉(zhuǎn)換系數(shù)；

m——所取藍(lán)靛果粉末的質(zhì)量；

n——稀釋倍數(shù)。

1.2.3 超聲輔助提取條件優(yōu)化

挑選果實(shí)成熟、果肉飽滿的藍(lán)靛果，干燥、粉碎。稱取2.00 g（準(zhǔn)確稱量至±0.01 g） 的粉碎后的藍(lán)靛果粉末，按1∶15的料液比取蒸餾水溶解藍(lán)靛果粉末于燒杯中，后置于一定溫度（30，40，50，60，70℃）的超聲清洗器水浴中浸提一定時(shí)間（20，40，60，80，100 min），并設(shè)置超聲波清洗器功率（150，175，200，225，250W）。取1mL稀釋后的提取液，加入1mL苯酚，5mL硫酸，冷卻至室溫，在波長(zhǎng)490 nm下測(cè)定吸光度A。計(jì)算藍(lán)靛果多糖濃度。

1.2.4 響應(yīng)曲面分析

選取超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率3個(gè)因素用Design-Expert 7.0.0進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)[16]。

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，以葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL） 為橫坐標(biāo)，于波長(zhǎng)490 nm下吸光度（A） 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.014 6X+0.002 1（R2=0.998 4）。

2.2 超聲輔助提取條件優(yōu)化分析

2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

在料液比1∶15，超聲溫度40℃，超聲功率175 W的提取條件下分別提取20，40，60，80，100min，在490 nm下測(cè)定吸光度A，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量并計(jì)算。

超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間在20～60 min時(shí)，吸光度隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，即提取的藍(lán)靛果含量隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；繼續(xù)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)吸光度呈下降趨勢(shì)，即藍(lán)靛果多糖的提取量呈下降趨勢(shì)。從圖2可以看出，超聲時(shí)間在60min時(shí)吸光度最高，即超聲時(shí)間60min時(shí)藍(lán)靛果多糖得率最大。由此可得，最佳的超聲時(shí)間為60min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2.2 超聲溫度對(duì)提取量的影響

在超聲時(shí)間60 min，超聲功率175 W，料液比1∶15的提取條件下分別用30，40，50，60，70℃的超聲溫度進(jìn)行提??；在490 nm下測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量并計(jì)算。

超聲溫度對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)提取率的影響

從圖3可以看出，當(dāng)超聲溫度在30～40℃時(shí)，吸光度隨超聲溫度的升高而增加，即提取的藍(lán)靛果多糖含量隨超聲溫度的升高而增加。這是由于藍(lán)靛果中的多糖能溶解到溶劑中，升高溫度使溶劑對(duì)多糖的提取能力增大（分子擴(kuò)散作用），加快了提取速率，進(jìn)而增加單位時(shí)間的提取量[17]。在超聲溫度為40℃時(shí)，吸光度達(dá)到最大，即所提取的藍(lán)靛果多糖含量最高。當(dāng)超聲溫度高于40℃時(shí)，吸光度隨超聲溫度的升高而降低并趨平，即所提取的藍(lán)靛果多糖含量開(kāi)始下降。由此可得，最優(yōu)提取溫度為40℃。

2.2.3 超聲功率對(duì)提取量的影響結(jié)果

在超聲時(shí)間60 min，超聲溫度40℃，料液比1∶15的提取條件下分別用 150，175，200，225，250W的功率進(jìn)行提??；在490 nm下測(cè)定吸光度。

超聲功率對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖4。

從圖4可以看出，當(dāng)超聲功率在150～175W時(shí)，吸光度隨超聲功率的升高而而增加，即提取的藍(lán)靛果多糖含量隨超聲功率的升高而增加。這是由于功率增大能加劇空氣泡的運(yùn)動(dòng)，當(dāng)超聲功率增加時(shí)，多糖提取率有所上升。在超聲功率為175W時(shí)，吸光度達(dá)到最大，即所提取的藍(lán)靛果多糖含量最高。當(dāng)超聲功率高于175W時(shí)，吸光度隨超聲功率的升高而降低，即所提取的藍(lán)靛果多糖含量開(kāi)始下降。由此可得，最佳超聲功率為175W。

圖4 超聲功率對(duì)提取率的影響

2.2.4 響應(yīng)曲面分析結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2中的數(shù)據(jù)通過(guò)Design Expert軟件進(jìn)行擬合分析，藍(lán)靛果多糖提取率與3個(gè)變量之間的關(guān)系表述為以下二階多項(xiàng)式方程。

利用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得超聲輔助提取藍(lán)靛果多糖對(duì)超聲時(shí)間（X1）、超聲溫度（X2）和超聲功率（X3）的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

響應(yīng)面模型方差分析見(jiàn)表3，回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表4。

從表3可見(jiàn)，試驗(yàn)所選用的模型高度顯著（p＜0.000 1），模型的校正決定系數(shù)R2adj=0.972 1，說(shuō)明該模型能解釋97.21%響應(yīng)值的變化；相關(guān)系數(shù)R=0.993 9，說(shuō)明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，該模型是合適的，可以用此來(lái)分析超聲輔助藍(lán)靛果多糖的提取。從表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型一次項(xiàng)X1，X2，交互項(xiàng)X1X2，X1X3顯著；二次項(xiàng) X12，v22，X32極顯著；X3，X2X3不顯著。

表3 響應(yīng)面模型方差分析

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

超聲溫度與超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)靛果多糖得率影響的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖5。

圖5 超聲溫度與超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)靛果多糖得率影響的響應(yīng)曲面

由圖5可以看出，在超聲功率為最佳值時(shí)，超聲溫度與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)藍(lán)靛果多糖得率產(chǎn)生了顯著性影響。從等高線可以看出，隨著超聲溫度和超聲時(shí)間的增加，多糖得率也在增長(zhǎng)；但超聲溫度大于40℃，超聲時(shí)間大于60 min后，超聲溫度和超聲時(shí)間的增加會(huì)導(dǎo)致藍(lán)靛果多糖得率的下降。

超聲功率與超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)靛果多糖得率影響的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖6。

圖6 超聲功率與超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)靛果多糖得率影響的響應(yīng)曲面

由圖6可以看出，當(dāng)超聲溫度為最佳條件時(shí)，超聲功率與超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)靛果多糖的得率有顯著影響。藍(lán)靛果多糖得率隨著超聲功率和超聲時(shí)間的增加而增長(zhǎng)，在超聲時(shí)間60 min，超聲功率175W時(shí)得率到達(dá)最大值，隨后藍(lán)靛果多糖得率隨超聲功率和超聲時(shí)間的增加而降低。

超聲功率與超聲溫度對(duì)藍(lán)靛果多糖得率影響的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖7。

由圖7可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間為最佳條件時(shí)，藍(lán)靛果多糖得率隨著超聲功率和超聲溫度的增加而增長(zhǎng)，在超聲時(shí)間60 min，超聲溫度40℃時(shí)得率到達(dá)最大值，隨后藍(lán)靛果多糖得率隨超聲功率和超聲溫度的增加而降低。

由回歸方程解得中心點(diǎn)的最佳解為超聲時(shí)間67.17min，超聲溫度41.36℃，超聲功率175.08W，預(yù)測(cè)最大提取得率24.263%。

調(diào)整預(yù)測(cè)最佳提取參數(shù)，超聲時(shí)間67 min，超聲溫度41℃，超聲功率175W。在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得結(jié)果為24.324%，模型與實(shí)際沒(méi)有顯著差異。

3 結(jié)論

圖7 超聲功率與超聲溫度對(duì)藍(lán)靛果多糖得率影響的響應(yīng)曲面

以干燥后的藍(lán)靛果為原料，通過(guò)熱水浸提法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探究超聲輔助提取藍(lán)靛果多糖的最佳工藝條件。單因素試驗(yàn)選取超聲時(shí)間、超聲溫度和超聲功率3個(gè)因素進(jìn)行研究，并設(shè)計(jì)三因素的響應(yīng)面試驗(yàn)。結(jié)果表明，單因素試驗(yàn)中的最佳條件為超聲時(shí)間60min，超聲溫度40℃，超聲功率175W；通過(guò)響應(yīng)面法得到最終提取工藝為超聲時(shí)間67min，超聲溫度41℃，超聲功率175 W，在此條件下藍(lán)靛果多糖得率為24.324%，與預(yù)測(cè)值相近，表明響應(yīng)面法優(yōu)化的提取條件可行。

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