郭熾鵬，陸春，朱國(guó)興

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚性病科，廣州 510630

解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum，U.urealyticum)感染可引起泌尿生殖系統(tǒng)疾病，也可導(dǎo)致腦、肺等其他器官損傷。目前，用于治療解脲脲原體感染的抗菌藥物主要有喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類，有關(guān)解脲脲原體對(duì)上述藥物的耐藥性研究已有報(bào)道。解脲脲原體對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥性增加的原因主要為gyrA、gyrB、parC和parE等基因的突變；對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性增加的原因主要為23S rRNA亞基或核糖體蛋白L4或L22基因的突變；對(duì)四環(huán)素類藥物耐藥性增加的原因主要為tet(M)的存在[1-11]。不同研究表明，以上這些耐藥突變位點(diǎn)的分布存在差異，生物膜的產(chǎn)生可能加重耐藥現(xiàn)象[12-13]。目前，關(guān)于解脲脲原體對(duì)喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類藥物耐藥性的研究主要集中在檢測(cè)上述突變位點(diǎn)。研究過(guò)程主要包括以下幾個(gè)步驟：①利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增目的基因；②對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；③與相應(yīng)ATCC株進(jìn)行序列比對(duì)并找出突變位點(diǎn)等[6,11,14]。本文通過(guò)PubMed檢索近幾年有關(guān)解脲脲原體耐藥性的相關(guān)研究，對(duì)已發(fā)現(xiàn)的耐藥位點(diǎn)分布和生物膜形成前后藥敏變化進(jìn)行歸納整理，以期加深對(duì)其耐藥機(jī)制的了解并指導(dǎo)耐藥菌快速檢測(cè)，從而加強(qiáng)抗菌藥物管理并減少耐藥性產(chǎn)生。

1 喹諾酮類藥物的耐藥突變

對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制研究主要集中在對(duì)gyrA、gyrB、parC和parE等基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining region，QRDR)相關(guān)突變位點(diǎn)的檢測(cè)。許多研究表明，發(fā)生于parC基因的典型突變S83L是導(dǎo)致解脲脲原體對(duì)喹諾酮類藥物耐藥性增加的常見(jiàn)原因[15-16]，Kawai等[14]研究表明，該突變可能導(dǎo)致喹諾酮類藥物對(duì)解脲脲原體的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)增加32倍。然而，并非所有研究均在耐藥菌株中檢測(cè)到上述4個(gè)基因突變[15,17]。在部分關(guān)于左氧氟沙星耐藥分離株的研究中，未能在gyrA、gyrB或parE等基因中檢出突變位點(diǎn)存在。

Piccinelli等[18]對(duì)篩選出的85株對(duì)環(huán)丙沙星和(或)氧氟沙星耐藥的支原體進(jìn)行分析，證實(shí)了一些已報(bào)道的突變位點(diǎn)，如parC中出現(xiàn)的S83L、E87Q和E87K，ParE中的R448K等。該研究結(jié)果顯示，對(duì)于從gyrA擴(kuò)增出的基因片段，最常見(jiàn)的突變是L176F，其他突變位點(diǎn)包括存在于微小脲原體(Ureaplasmaparvum，U.parvum)中的F67I、K78I、G179D、S174R，以及解脲脲原體(T960)中的D77V。在parC中檢出4個(gè)突變：微小脲原體中的V141I(該突變導(dǎo)致對(duì)氧氟沙星產(chǎn)生中等程度耐藥)，以及解脲脲原體(T960)中的I52N、L49F和E153D。通過(guò)對(duì)gyrB基因序列進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)微小脲原體分離株中存在E502Q、R523等突變，并在1株解脲脲原體(T960)分離株中發(fā)現(xiàn)三重突變。在5株微小脲原體菌株中檢測(cè)到parE基因中的6個(gè)點(diǎn)突變：Q412K、Q412P、S413N、H491Q、E466K和M404L。上述突變導(dǎo)致相應(yīng)表達(dá)蛋白發(fā)生7個(gè)氨基酸替換。

不同突變可存在于同一基因中，如有研究發(fā)現(xiàn)耐喹諾酮類藥物的解脲脲原體血清型1中同時(shí)存在F67I和K78I兩個(gè)點(diǎn)突變[18]。同一菌株中也可能存在兩個(gè)基因的雙重突變。對(duì)于微小脲原體不同血清型和解脲脲原體兩種生物群混雜感染的分離株，Piccinelli等在其中3株分離株中發(fā)現(xiàn)了如下突變：gyrA中的L176F、雙重突變(gyrA基因中的L176F和parE基因中的Q412T)。Kawai等[14]在一份DNA樣品中同時(shí)檢出存在于gyrB基因和parC基因中的點(diǎn)突變(分別為P462S和S83L)。

并非所有基因突變均能導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生。例如，在一些多重突變菌株中檢測(cè)到S83L，因此除S83L外可能存在中性突變。Valentine-King等[17]在對(duì)喹諾酮類藥物敏感的解脲脲原體分離株中發(fā)現(xiàn)了存在于parE基因QRDR內(nèi)的兩個(gè)突變位點(diǎn)，其中一個(gè)導(dǎo)致R437I非同義替換，另一個(gè)導(dǎo)致G480S非同義替換，該分離株對(duì)左氧氟沙星和環(huán)丙沙星均較敏感(MIC分別為1 μg/mL和2 μg/mL)，與其他受試菌株的敏感性一致。因此，這種突變雖然位于parE的QRDR，但似乎不會(huì)降低喹諾酮類藥物的有效性。

在對(duì)耐藥位點(diǎn)的檢測(cè)中還發(fā)現(xiàn)了一些尚未證明是否介導(dǎo)耐藥的突變位點(diǎn)，如發(fā)生于gyrA基因的L176F，gyrB基因的E502Q，以及parE基因的Q412K、Q412P、Q412T等[18]。

為評(píng)價(jià)parC基因S83L和S83W突變對(duì)表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)變化的影響，Kawai等[14]通過(guò)同源建模等技術(shù)對(duì)各肽的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)喹諾酮C-3羧酸、C-4羰基和Mg2+對(duì)其與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的相互作用有重要影響，而S83L和S83W可通過(guò)位阻作用干擾菌株與喹諾酮類藥物的適當(dāng)結(jié)合。

2 四環(huán)素類藥物的耐藥突變

對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥機(jī)制研究主要集中在tet(M)檢測(cè)。Valentine-King等[17]對(duì)四環(huán)素類耐藥解脲脲原體分離株和4株敏感分離株中的tet(M)片段進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測(cè)，獲得約400 bp的條帶，相當(dāng)于解脲脲原體ATCC 33175中的tet(M)位置，而敏感分離株中未檢測(cè)到該基因。

然而，并非檢測(cè)出tet(M)決定簇的菌株均對(duì)四環(huán)素類產(chǎn)生耐藥。Fernández等[15]在250株分離株中篩選與四環(huán)素類耐藥相關(guān)的tet(M)決定簇，發(fā)現(xiàn)10株(4.9%)微小脲原體分離株呈陽(yáng)性(其中僅1株對(duì)四環(huán)素耐藥，另外9株的四環(huán)素和多西環(huán)素MIC均較低)，而在解脲脲原體(T960)中未分離出該基因。Kotrotsiou等[19]利用A7瓊脂平板，從100例成人泌尿生殖系統(tǒng)中分離出解脲脲原體，其中87份標(biāo)本分離出微小脲原體，12份標(biāo)本分離出解脲脲原體(T960)，兩生物群均從單一樣品中分離出來(lái)，且所有分離株均對(duì)四環(huán)素表型敏感。檢測(cè)上述樣本，發(fā)現(xiàn)35株攜帶tet(M)，其中29株(82.9%)為微小脲原體、5株(14.3%)為解脲脲原體(T960)、1株(2.9%)為微小脲原體/解脲脲原體(T960)混合株，3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。10例有癥狀男性患者中有4例(40%)tet(M)攜帶者，34例有癥狀女性患者有11例(32.4%)tet(M)攜帶者，而56例無(wú)癥狀婦女中亦有20例(35.7%)tet(M)攜帶者，3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

生殖器支原體對(duì)四環(huán)素類產(chǎn)生耐藥性主要是由于獲得了tet(M)決定簇，該過(guò)程通常與Tn916/Tn1545家族的接合轉(zhuǎn)座子元件相關(guān)。Mardassi等[20]對(duì)取自突尼斯境內(nèi)部分不育癥患者的20株微小脲原體和2株解脲脲原體(T960)分離株進(jìn)行四環(huán)素耐藥性評(píng)估，并通過(guò)PCR檢測(cè)tet(M)和int-Tn(int-Tn基因編碼Tn916/Tn1545樣轉(zhuǎn)座子的整合酶)。微小脲原體對(duì)四環(huán)素的耐藥率為 22.72%，且所有耐藥菌株均含tet(M)和int-Tn序列。對(duì)tet(M)擴(kuò)增子的核苷酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)微小脲原體和解脲脲原體(T960)中所有耐四環(huán)素分離株均具有一種獨(dú)特的序列。分子分型研究表明，單個(gè)tet(M)基因序列最有可能通過(guò)Tn916/Tn1545樣轉(zhuǎn)座子來(lái)傳遞，從而導(dǎo)致微小脲原體和人型支原體(Mycoplasmhominis)分離株中出現(xiàn)大部分四環(huán)素耐藥突變株。tet(M)基因序列存在于不同支原體屬中，且廣泛存在于系統(tǒng)發(fā)育狀態(tài)不同的菌株中。一個(gè)合理的解釋是，它可能受益于有效的水平轉(zhuǎn)移環(huán)境，從而具有高度的傳播能力。

3 大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥突變

對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥機(jī)制研究主要集中在對(duì)23S rRNA亞基或核糖體蛋白L4或L22基因的檢測(cè)。Govender等[11]在對(duì)紅霉素(2株)和紅霉素+阿奇霉素(1株)產(chǎn)生耐藥性的3株微小脲原體中觀察到L22核糖體蛋白突變，其中菌株Up-8顯示6個(gè)氨基酸改變，Up-38顯示3個(gè)氨基酸改變，Up-71顯示6個(gè)氨基酸改變。而在另一株紅霉素+阿奇霉素抗性菌株中未檢測(cè)到L22蛋白變化。4株菌株未發(fā)現(xiàn)以下序列突變：兩個(gè)23S rRNA操縱子；大環(huán)內(nèi)酯修飾基因erm(A)、erm(B)、erm(C)和erm(E)；外排泵基因msr(A)、msr(B)、msr(C)和msr(D)。

Dando等[21]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)12只懷孕母羊于妊娠55 d時(shí)進(jìn)行羊膜內(nèi)接種，接種物為含多種微小脲原體亞型的臨床株。隨后于妊娠100 d時(shí)用紅霉素治療(肌內(nèi)注射，每日30 mg/kg，n=6)或注射生理鹽水(肌內(nèi)注射，n=6)，并于妊娠125 d后經(jīng)外科手術(shù)取出胎羊。盡管所有母羊注射了相同接種物，但慢性羊膜內(nèi)感染后，在羊水和絨毛膜羊膜內(nèi)檢測(cè)到的脲原體存在顯著差異。從絨毛膜羊膜(而不是羊水)中分離出的脲原體23S rRNA基因的結(jié)構(gòu)域Ⅴ中觀察到許多多態(tài)性，導(dǎo)致鑲嵌樣序列形成。絨毛膜羊膜分離株還含有大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因erm(B)和msr(D)，且與羅紅霉素MIC有關(guān)。值得注意的是，這種變化與脲原體是否接觸紅霉素?zé)o關(guān)，表明低劑量紅霉素不會(huì)誘導(dǎo)子宮內(nèi)脲原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥。

4 生物膜形成與耐藥性

解脲脲原體具有形成生物膜的能力，有研究提示其生物膜形成后藥物敏感性下降。García-Castillo等[12]對(duì)9株具有生物膜形成能力的解脲脲原體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)生物膜形成前后菌株的耐藥性發(fā)生如下變化：紅霉素0%對(duì)44%(P=0.02)，泰利霉素22%對(duì)77%(P=0.02)，環(huán)丙沙星66%對(duì)100%，左氧氟沙星0%對(duì)33%，四環(huán)素0%對(duì)33%；所有菌株在生物膜形成前后均對(duì)克拉霉素敏感。Feng等[13]對(duì)69株解脲脲原體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)42株為耐藥株(同時(shí)耐環(huán)丙沙星和氧氟沙星)，27株為敏感株(對(duì)環(huán)丙沙星和氧氟沙星均敏感)，且耐藥菌比敏感菌產(chǎn)生更多生物膜(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，生物膜形成后MIC增加，代謝相關(guān)基因ureC表達(dá)增加(P<0.05)，但喹諾酮類耐藥相關(guān)基因gyrA的表達(dá)在生物膜形成前后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

也有研究顯示，生物膜形成前后解脲脲原體的藥物敏感性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Pandelidis等[22]檢測(cè)來(lái)自早產(chǎn)新生兒的43株臨床分離株和5株ATCC菌株在生物膜形成前后的藥物敏感性，發(fā)現(xiàn)生物膜形成前后阿奇霉素和紅霉素的藥物敏感性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。阿奇霉素對(duì)解脲脲原體(T960)臨床分離株的MIC50和50%最小生物膜形成抑制濃度(50% minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC50)高于微小脲原體，但支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)嬰兒與非BPD嬰兒的MIC或MBIC無(wú)差異。

5 藥物敏感性與多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)

上述研究主要集中于對(duì)已知突變位點(diǎn)的檢測(cè)，而MLST為研究解脲脲原體耐藥株的分布提供了新的思路。為更好地了解解脲脲原體的分子流行病學(xué)和群體結(jié)構(gòu)，Zhang等[23]開發(fā)了基于解脲脲原體4個(gè)管家基因(ftsH、rpL22、valS、thrS)的MLST方案，應(yīng)用于藥物敏感性菌株研究，并檢測(cè)超流行譜系和致病株。Fernández等[15]使用針對(duì)4個(gè)管家基因的引物，對(duì)46株分離株[30 株微小脲原體和16株解脲脲原體(T960)]進(jìn)行MLST分析，包括左氧氟沙星耐藥分離株、所有攜帶tet(M)分離株，以及代表不同研究時(shí)期和樣品來(lái)源的一組敏感分離株，利用eBURST軟件建立克隆性并確定分離物之間的潛在關(guān)系。MLST結(jié)果顯示，30株微小脲原體存在14個(gè)克隆群，屬于同一克隆復(fù)合體(clonal complex，CC)且具有3個(gè)共有基因座的ST1和ST56是最常見(jiàn)的克隆群，分別有6株和5株。16株解脲脲原體(T960)中存在7個(gè)譜，其中ST47(5株)和ST9(3株)屬于同一CC，且最為常見(jiàn)。eBURST軟件分析提示，有3個(gè)主要簇(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和1個(gè)獨(dú)立的不可分組的克隆群(兩個(gè)分離物)存在。 Ⅰ類群包括整個(gè)微小脲原體分離株，而解脲脲原體(T960)分離株大部分分布在Ⅱ類和Ⅲ類群，但該研究未觀察到ST與微生物耐藥性之間的相關(guān)性。目前，解脲脲原體藥物敏感性與MLST相關(guān)研究仍較少，需更多研究來(lái)支持。

6 結(jié)語(yǔ)

解脲脲原體耐藥性研究對(duì)指導(dǎo)臨床用藥及減少耐藥性發(fā)生有重要意義，但目前研究方法和檢驗(yàn)手段仍較為傳統(tǒng)、局限，研究方案也僅停留在對(duì)前人實(shí)驗(yàn)的重復(fù)。在完善耐藥機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，如何實(shí)現(xiàn)對(duì)耐藥株的快速鑒定，從而指導(dǎo)抗菌藥物的合理選擇等仍需進(jìn)一步研究。