趙婧伊，左志輝

(1. 天津市新華中學(xué) 天津300204；2. 天津市藥品檢驗研究院 天津300070)

替比夫定片用于有病毒復(fù)制證據(jù)以及有血清轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)升高或肝組織活動性病變證據(jù)的慢性乙型肝炎的治療[1]。替比夫定片現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)為 WS1-(X-077)-2010Z，在國外藥典中未見收載。試驗研究發(fā)現(xiàn)，有關(guān)物質(zhì)檢查供試品溶液濃度較低，為0.12,mg/mL，胸腺嘧啶峰響應(yīng)很小，幾乎無法檢出，該方法靈敏度較低。含量測定供試品溶液配制方法不合理，使測定結(jié)果不準(zhǔn)確，且有機(jī)溶劑使用量較大，產(chǎn)生較大浪費。經(jīng)方法學(xué)驗證，對有關(guān)物質(zhì)濃度與含量測定供試液的配制方法進(jìn)行了修訂，并將系統(tǒng)適用性溶液中胸腺嘧啶與替比夫定濃度均增加5倍，修訂為 0.6,μg/mL(0.1%,)和 0.6,mg/mL，提高了方法的靈敏度與準(zhǔn)確度。本研究建立的方法將更有效控制我國替比夫定片的質(zhì)量。

1 材 料

安捷倫 HP1260型高效液相色譜儀；安捷倫HP1200型高效液相色譜儀；色譜柱：YMC-Pack ODS-AQ 柱(3,mm×150,mm，3,μm)、Agilent SB-Ag柱(5,mm×250,mm，5,μm)。

乙腈為色譜純，水為去離子水。替比夫定、胸腺嘧啶對照品均由北京某制藥有限公司提供(批號分別為 H2982、H3127)，純度 100.0%,、99.8%,。替比夫定片由北京某制藥有限公司生產(chǎn)，批號分別為 X0593、X0587、X0584。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

用親水性十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(YMC-Pack ODS-AQ 柱，150,mm×3,mm，3,μm)；以水為流動相 A，以乙腈-水(40∶60)為流動相 B，按表 1進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為 40,℃；檢測波長為220,nm。稱取胸腺嘧啶 6,mg，置 100,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)溶解并稀釋至刻度，搖勻，量取1,mL置100,mL量瓶中，加替比夫定60,mg，加乙腈-水(5∶100)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。取 10,μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)流速使替比夫定峰的保留時間約為 9,min，胸腺嘧啶峰與替比夫定峰的相對保留時間為0.7。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 含量測定供試品溶液的制備

取本品 10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于替比夫定 120,mg)，置 100,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲 15,min使替比夫定溶解，放冷，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，取混懸液適量，4,000,r/min離心 15,min，精密量取上清液 5,mL，置 50,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.2 含量測定對照品溶液的制備

精密稱取替比夫定對照品約 30,mg，置 250,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲使溶解，放冷，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.3 有關(guān)物質(zhì)供試品溶液的制備

精密量取含量測定項下離心后上清液 5,mL，置10,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.4 有關(guān)物質(zhì)對照品溶液的制備

精密量取含量測定項下的對照品溶液 5,mL置200,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液(0.5%,)。

2.3 線性試驗

取替比夫定對照品約 30,mg，精密稱定，置250,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲使之溶解、放冷，并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。分別精密量取 0.05,mL、0.10,mL、0.25,mL、0.5,mL、2.5,mL、5,mL、10,mL 置 100,mL 量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，分別精密取上述溶液與貯備液10,μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以替比夫定濃度 C對峰面積 A作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在 0.06～241.8,μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為A＝32.592,C+4.672，r＝0.999,9(n＝7)。

取胸腺嘧啶對照品約 12,mg，精密稱定，置200,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲使溶解、放冷，稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，分別精密量取 0.5,mL、1,mL、5,mL、10,mL、20,mL，置 100,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取上述溶液 10,μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以胸腺嘧啶濃度C(μg/mL)對峰面積A作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在 0.29～11.63,μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：A＝54.568,1,C+0.541,4，r＝1.000,0(n＝5)。

2.4 精密度試驗

精密稱取替比夫定片(批號 X0584)細(xì)粉適量(約相當(dāng)于替比夫定 120,mg)，共 6份，按“2.1”項方法測定，胸腺嘧啶均未檢出，其他單一最大雜質(zhì)均為0.021%,，其他雜質(zhì)總量均為 0.040%,。本方法的精密度較好。

2.5 重復(fù)性試驗

精密量取有關(guān)物質(zhì)檢查項下的對照溶液(0.5%)10,μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，6針峰面積RSD為0.21%。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性較好。

2.6 加樣回收率試驗

分別取替比夫定對照品 0.096,mg、0.12,mg、0.14,mg，置 100,mL量瓶中，每個濃度配制 3份，并分別加入相應(yīng)量的空白輔料，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲15,min使溶解、放冷，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，取混懸液適量，4,000,r/min離心15,min，精密量取上清液 5,mL，置 50,mL量瓶中，用乙腈-水(5∶100)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別相當(dāng)于 80%,、100%,、120%,含量濃度的 3組各 3份。另取替比夫定對照品 30,mg，至 100,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲使溶解，放冷，并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液，按照有關(guān)物質(zhì)項下色譜條件分別進(jìn)樣 10,μL，測定峰面積，計算平均回收率為100.0%，RSD 為0.40(n＝9)，結(jié)果見表 2。

表2 含量測定回收率結(jié)果Tab.2 Recoveries of telbivudine content determination

2.7 靈敏度測試溶液

取對照品溶液(0.5%,)稀釋至替比夫定濃度約為0.18,μg/mL，按照含量測定項下色譜條件測定，替比夫定峰信噪比為 16，主峰面積可準(zhǔn)確積分，以此作為靈敏度測試溶液(0.03%,)。

2.8 最低檢出限

取對照溶液(0.5%,)逐步稀釋，量取 10,μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，替比夫定與胸腺嘧啶的最小檢出限均為 0.06,μg/mL(0.01%,)。

2.9 溶液穩(wěn)定性

取供試品溶液(批號 X0593)，分別放置 0,h、15,h、24,h后測定，記錄色譜圖，胸腺嘧啶均未檢出，其他單一最大雜質(zhì)分別為 0.021%,、0.021%,、0.022%,；其他雜質(zhì)總量分別為 0.040%,、0.037%,、0.049%。表明供試品溶液在24,h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 粗放度試驗

表3 有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果(粗放度試驗)Tab.3 Test results of related substances(extensive degree test)

方法 1：Agilent1260型高效液相色譜儀；YMCPack ODS-AQ 柱(150,mm×3,mm，3,μm)；

方法 2：Agilent1200型高效液相色譜儀；Agilent SB-Ag柱(250,mm×4.6,mm，5,μm)。

使用2種不同型號的色譜柱測定有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果基本一致(見表3)。YMC-Pack ODS-AQ柱的性能略優(yōu)于安捷倫色譜柱，故在擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中予以列出。

3 樣品測定與結(jié)果

3.1 含量測定結(jié)果

按“2.2.1與2.2.2”項下方法制備供試品溶液與對照品溶液；照“2.1”項下的色譜條件，精密量取供試品溶液與對照品溶液各 10,μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算，即得。3批樣品含量測定結(jié)果見表 4，與原國標(biāo)方法結(jié)果基本一致。含量測定典型色譜圖見圖1、2。

表4 樣品含量測定結(jié)果(%)Tab.4 The results of content determination(%)

圖1 對照品溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference solution

圖2 供試品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of test solution

3.2 有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

圖3 有關(guān)物質(zhì)檢查-對照溶液(0.5%)色譜圖Fig.3 Chromatogram of reference solution

圖4 有關(guān)物質(zhì)檢查-供試品溶液(X0584)色譜圖Fig.4 Chromatogram of test solution

圖5 有關(guān)物質(zhì)檢查-流動相(溶劑)色譜圖Fig.5 Chromatogram of mobile phase

圖6 有關(guān)物質(zhì)檢查-空白輔料色譜圖Fig.6 Chromatogram of blank solution

按“2.2.1與2.2.2”項下方法制備供試品溶液與對照品溶液，取靈敏度測試溶液10,μL注入液相色譜儀，主成分色譜峰的信噪比應(yīng)不小于10。照含量測定項下的色譜條件，精密量取供試品溶液與對照溶液各10,μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液的色譜圖中如有與胸腺嘧啶相應(yīng)的雜質(zhì)峰，按外標(biāo)法計算并乘以0.6的校正因子，不得超過替比夫定標(biāo)示量的 0.2%，其他單個雜質(zhì)不得超過替比夫定標(biāo)示量的 0.1%，其他雜質(zhì)總量不得超過替比夫定標(biāo)示量的 0.3%，各雜質(zhì)總量不得超過替比夫定標(biāo)示量的0.5%。3批樣品測定結(jié)果見表 2方法 1，典型色譜圖見圖 3～7。

圖7 系統(tǒng)適用性試驗Fig.7 Chromatogram of system suitability solution

4 討 論

4.1 系統(tǒng)適用性試驗

原國家標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)檢查與含量測定供試品溶液濃度一致，均為 0.12,mg/mL。按原國家標(biāo)準(zhǔn)，照含量測定項下進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗，采用 Agilent SBAq柱(250,mm×5,mm，5,μm)，系統(tǒng)適用性溶液無法檢出胸腺嘧啶峰。改用 YMC-Pack ODS-AQ柱(150,mm×3,mm，3,μm)，胸腺嘧啶峰雖可檢出，但響應(yīng)很小，靈敏度較低。經(jīng)試驗，將胸腺嘧啶與替比夫定濃度均增加 5倍，修訂為 0.6,μg/mL(0.1%)和0.6,mg/mL。經(jīng)粗放度試驗驗證，不同型號的 2種色譜柱均可檢出胸腺嘧啶，提高了方法的靈敏度。

4.2 有關(guān)物質(zhì)供試品溶液濃度的選擇

按原國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定替比夫定片有關(guān)物質(zhì)，3批樣品均未檢出雜質(zhì)。根據(jù)系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果，相應(yīng)地將有關(guān)物質(zhì)供試品溶液濃度增加5倍，修訂為0.6,mg/mL。含量測定的供試品溶液濃度仍維持原標(biāo)準(zhǔn)濃度0.12,mg/mL不變。

4.3 含量測定供試品溶液的配制

原國家標(biāo)準(zhǔn)含量測定中規(guī)定“取本品 20片，置于已定容的 1,000,mL乙腈-水(5∶100)溶液中……”。經(jīng)試驗，加入替比夫定片20片后，溶液體積會增加至 1,015,mL。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的供試品溶液配制方法不合理，對含量測定結(jié)果影響較大，且產(chǎn)生很大浪費。經(jīng)試驗，將供試品溶液的配制方法修訂為“取本品 10片，精密稱定，研細(xì)混勻，精密稱取適量(約相當(dāng)于替比夫定0.12,g)，置100,mL量瓶中，加乙腈-水(5∶100)適量，超聲 15,min使替比夫定溶解……”。

4.4 離心與濾膜濾過的比較

供試品溶液分別采用離心與濾膜濾過，含量測定結(jié)果一致，均為 98.6%。故維持原國家標(biāo)準(zhǔn)的方法，離心后取上清液稀釋?！?/p>

［1］陳新謙. 新編藥物學(xué)[M]. 14版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：424.

［2］國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)[S]. (WS1-(X-077)-2010Z. 2010.

［3］李發(fā)美. 分析化學(xué)[M]. 5版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：21.