劉玉洋，葉生月，閔 會(huì)，王慧中*，盧江杰*

(1.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036； 2.浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310036； 3.桐廬縣農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化辦公室，浙江 桐廬 311500； 4.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 杭州 310052)

決明屬植物全世界約590種，我國(guó)原產(chǎn)約10種，中部、東南部、南部及西南部各省區(qū)均有分布[1]。入藥用的約19種，具清熱明目、潤(rùn)腸通便的功效，常用來(lái)治療便秘、眼病、皮癬、水腫、高血壓和頭痛等病癥。常見(jiàn)以種子入藥的有小決明(CassiatoraL.)、望江南(C.occidentalisL.)和槐葉決明(C.sopheraL.)等[2]。小決明的種子即最常用的中藥“決明子”，目前廣泛用于治療高血脂癥、高血壓，由于瀉下作用緩和又可降脂，成為減肥用品中的最常用組分之一。望江南在醫(yī)藥上常用作緩瀉劑，種子炒后治瘧疾；根有利尿功效；鮮葉搗碎治毒蛇毒蟲(chóng)咬傷。但有微毒，牲畜誤食過(guò)量可以致死，近來(lái)關(guān)于望江南中毒病例的報(bào)道逐漸增多[3]?；比~決明也稱(chēng)“茳芒決明”，據(jù)《中藥大辭典》中記載：“茳芒決明，性平，無(wú)毒，味甘滑”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究還表明槐葉決明葉的醇提物有松弛支氣管平滑肌等作用[4-6]。

民間歷來(lái)有望江南代替決明使用的情況，而望江南和槐葉決明由于形態(tài)相似，也?；煊肹2]。所以如何區(qū)分決明屬不同種是中藥質(zhì)量研究的熱點(diǎn)之一。宋賢麗等[7]采用高效毛細(xì)管電泳對(duì)決明屬植物種子中的水溶性成分進(jìn)行分析，可以較好地區(qū)分6種決明屬植物。此外，蒽醌類(lèi)、黃酮類(lèi)和萜類(lèi)等化學(xué)成分的化學(xué)指紋圖譜被廣泛應(yīng)用于決明屬植株的研究[8-9]。近年來(lái)，DNA分子標(biāo)記也開(kāi)始在決明屬植物中得到應(yīng)用。如王靜等[10]建立了SRAP分子標(biāo)記體系，可用于決明屬植物的遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定等研究。但是可用的SRAP分子標(biāo)記數(shù)量有限，一定程度上限制了決明屬植物大規(guī)模研究工作的開(kāi)展。隨著高通量測(cè)序技術(shù)被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組分析，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組序列開(kāi)發(fā)全基因組SSR分子標(biāo)記，用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、目標(biāo)基因定位以及指紋圖譜繪制等研究成為可能[11]。Jain等[12]在沙棘轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)7.69%的序列含有SSR位點(diǎn)，而且平均每6.704 kb就有一個(gè)SSR位點(diǎn)。Li等[13]通過(guò)同色兜蘭3.77 Gb的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從3 975條含有SSR位點(diǎn)的序列中獲得4 989對(duì)SSR引物。Zeng等[14]從箭葉淫羊藿轉(zhuǎn)錄組序列中隨機(jī)選擇32個(gè)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，其中18對(duì)引物可以擴(kuò)增出條帶。目前決明屬的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)分析槐葉決明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法搜尋SSR位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)SSR標(biāo)記的引物，進(jìn)而利用SSR標(biāo)記分析小決明、望江南和槐葉決明等決明屬材料，以期利用開(kāi)發(fā)的決明屬SSR分子標(biāo)記進(jìn)行該屬植物的種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析等相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為不同地區(qū)收集的1份槐葉決明種子、3份望江南種子和5份小決明種子，具體信息見(jiàn)表1。種子發(fā)芽后，溫室內(nèi)正常培養(yǎng)，待植株長(zhǎng)到20 cm高后，采集新鮮葉片，液氮冷凍處理后，超低溫保存，用于后續(xù)提取DNA。

表1 材料編號(hào)名稱(chēng)與產(chǎn)地

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測(cè)

DNA提取參考Doyle等[15]的CTAB法，利用超微量紫外分光光度計(jì)(NanoUV-3000)進(jìn)行DNA濃度測(cè)定。并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和SSR位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

利用MISA軟件對(duì)浙江省藥用植物種質(zhì)改良和質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室擁有的槐葉決明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，按照軟件默認(rèn)參數(shù)鑒定單堿基重復(fù)SSR、雙堿基重復(fù)SSR、三堿基重復(fù)SSR、四堿基重復(fù)SSR、五堿基重復(fù)SSR和六堿基重復(fù)SSR。

使用軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)置的主要參數(shù)為：EST序列長(zhǎng)度在150 bp以上；引物長(zhǎng)度控制在18～25 bp；避免產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)如dimer，hairpin，falseprimer等；CG含量在40%～70%；退火溫度處于45.0～65.0 ℃；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在100～300 bp。引物由上海生工公司合成。

1.2.3 SSR分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增和引物篩選

PCR反應(yīng)體系(10 μL)如下：10×PCR Buffer 1 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.3 μL，10 μmol·L-1的正向和反向引物各0.5 μL，2 U·L-1Taq酶0.5 μL，20 ng·μL-1DNA模板1 μL，ddH2O 6.2 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min，32個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，各引物退火溫度下復(fù)性40 s，72 ℃延伸90 s)，最后72 ℃延伸10 min。選擇2個(gè)材料的基因組DNA篩選合成的SSR引物，選出條帶清晰且多態(tài)性好的引物用于后續(xù)所有材料的PCR擴(kuò)增。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳和數(shù)據(jù)分析

將8%丙烯酰胺40 mL，10%過(guò)硫酸銨280 μL，TEMED 26 μL，混合均勻后水平灌膠，插上68孔梳子，水平放置直至膠凝固(30 min左右)。在電泳槽中加入適量1×TBE緩沖液，上樣，在200 V電壓下電泳分離2 h。電泳結(jié)束后，用蒸餾水將凝膠漂洗2 min后，置入800 mL 0.1%的AgNO3溶液中染色25 min(期間使用搖床搖動(dòng))；之后在蒸餾水中漂洗2次，每次10 s。將漂洗之后的凝膠放入含有800 mL 1%的氫氧化鈉溶液中(含2 mL甲醛)顯影，搖床搖動(dòng)直至凝膠上出現(xiàn)清晰的條帶。用蒸餾水漂洗10 s。

使用BIO-RAD visadoc 3.0(Bio-RAD，USA)成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠掃描后，通過(guò)Quantity One軟件依據(jù)DNA Marker計(jì)算每個(gè)條帶的分子量大小，并依據(jù)SSR標(biāo)記的預(yù)計(jì)大小和重復(fù)單元進(jìn)行矯正，確定等位變異大小(bp)和數(shù)量，由軟件PowerMarker version 3.25[16]進(jìn)行遺傳豐富度(A)和多態(tài)信息量(PIC)等多樣性指數(shù)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 槐葉決明轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)分布特點(diǎn)

利用MISA軟件對(duì)拼接得到的103 305條槐葉決明unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，共檢測(cè)到15 753個(gè)SSR位點(diǎn)，可用于標(biāo)記開(kāi)發(fā)。如表2所示，單堿基重復(fù)數(shù)SSR位點(diǎn)數(shù)占39.55%，其中以A/T占比最大(38.51%)；雙堿基重復(fù)數(shù)占27.40%，其中AG/CT占9.36%；三堿基重復(fù)數(shù)占30.84%，其中AAG/CTT占9.36%；四堿基重復(fù)數(shù)占1.44%，其中AAAG/CTTT占0.37%；五堿基重復(fù)數(shù)占0.23%，其中AAAAG/CTTTT占0.03%；六堿基重復(fù)數(shù)占0.53%，其中AAGAGG/CCTCTT占0.01%。

2.2 SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證

對(duì)15 753個(gè)SSR位點(diǎn)利用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，最終有10 110個(gè)SSR位點(diǎn)可以設(shè)

表2 槐葉決明轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)各類(lèi)型的情況

計(jì)SSR引物。隨機(jī)選擇50對(duì)SSR引物由上海生工合成，通過(guò)PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳，銀染，拍照，經(jīng)初步篩選得到25對(duì)條帶清晰、有差異的SSR引物可用于后續(xù)不同產(chǎn)地槐葉決明遺傳多樣性分析。這些標(biāo)記的等位基因數(shù)量從2到7不等，平均有2.72個(gè)等位基因；遺傳豐富度從0.20到0.73不等，平均為0.45；PIC從0.18到0.70不等，平均為0.39(表3)。圖1為SSR引物CPtSSR008在不同試驗(yàn)材料中的電泳結(jié)果。

表3 本研究中用于遺傳多樣性分析的25對(duì)SSR分子標(biāo)記信息

1～9分別表示本研究中使用的決明屬種質(zhì)資源材料，與表1相同。M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量圖1 引物CPtSSR008的電泳結(jié)果

2.3 不同決明屬材料的遺傳多樣性分析

根據(jù)25對(duì)SSR引物電泳結(jié)果，通過(guò)聚類(lèi)距離比較分析發(fā)現(xiàn)：槐葉決明和不同產(chǎn)地決明子、不同產(chǎn)地決明子之間遺傳距離在0.111～0.963，其中槐葉決明、小決明和望江南各種之間，以及小決明和望江南不同地理來(lái)源之間均存在較大遺傳差異(表4)。

進(jìn)一步通過(guò)遺傳聚類(lèi)分析，我們發(fā)現(xiàn)槐葉決明、小決明和望江南可分為三類(lèi)：槐葉決明為第一類(lèi)；河北、安徽、北京產(chǎn)地的望江南為第二類(lèi)；四川、廣西、廣東、甘肅、河南產(chǎn)地的小決明為第三

表4 各材料的遺傳距離

類(lèi)(圖2)。從種子外觀上看，槐葉決明種子與決明差異較大，這與利用SSR分子標(biāo)記鑒定的結(jié)果一致，而不同產(chǎn)地的槐葉決明和望江南材料無(wú)論種子還是植株根莖葉差異都不大，很難從外觀上鑒定出不同，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，我們鑒定出了槐葉決明和不同產(chǎn)地望江南的差異，從而為槐葉決明和望江南的種質(zhì)資源分析鑒定提供依據(jù)。

圖2 基于SSR分子標(biāo)記的決明屬遺傳聚類(lèi)

3 小結(jié)與討論

通過(guò)分析槐葉決明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究共發(fā)掘了15 753個(gè)SSR位點(diǎn)，并成功設(shè)計(jì)出10 110對(duì)SSR引物。隨機(jī)選取其中的50對(duì)SSR引物中，有電泳條帶清晰和多樣性高的SSR引物25對(duì)，可用于本實(shí)驗(yàn)室收集的決明屬材料遺傳多樣性分析以及種質(zhì)資源鑒定。因此，我們預(yù)計(jì)本研究共開(kāi)發(fā)決明屬SSR標(biāo)記5 000個(gè)左右。而且這些標(biāo)記可為槐葉決明、小決明和望江南3個(gè)種為代表的決明屬材料相關(guān)研究提供分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)。

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社, 1988: 125.

[2] 連文琰. 中國(guó)決明屬藥用植物簡(jiǎn)報(bào)[J]. 中草藥, 1986, 17(70): 27.

[3] 韓文雯, 李天祥. 望江南子的生藥學(xué)研究[J]. 天津藥學(xué), 2011, 23(3): 49-51.

[4] SINGH R, HUSSAIN S, VERMA R, et al. Anti-mycobacterial screening of five Indian medicinal plants and partial purification of active extracts ofCassiasopheraandUrticadioica[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 2013,6(5):366-371.

[5] TIWARI R D, MISRA G. Chemical examination of the flowers ofCassiasophera[J]. Planta Medica, 1975, 28(2): 182-185.

[6] ZHAO Y, LIU J P, LU D, et al. A novel cycloartane triterpene glycoside from the seeds ofCassiasopheraL. [J]. Natural Product Research, 2007, 21(6): 494-499.

[7] 宋賢麗, 郭寶林, 劉克武, 等. 6種決明屬藥用植物種子毛細(xì)管電泳法鑒別[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2003,28(6): 14-19.

[8] 李婷, 馮占民, 楊巡紜, 等. 決明屬植物的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2012, 32(6): 107-118.

[9] 胡勇, 陳麗瓊, 朱霞, 等. 決明屬化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐, 2013, 27(5): 69-71.

[10] 王靜, 張躍進(jìn), 梁宗鎖, 等. 決明DNA提取、SRAP-PCR優(yōu)化及引物篩選[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(2): 137-142.

[11] KALIA R K, RAI M K, KALIA S, et al. Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants [J]. Euphytica, 2011, 177(3): 309-334.

[12] JAIN A, CHAUDHARY S, SHARMA P C. Mining of microsatellites using next generation sequencing of seabuckthorn (HippophaerhamnoidesL.) transcriptome [J]. Physiology and Molecular Biology of Plants: An International Journal of Functional Plant Biology, 2014, 20(1): 115-123.

[13] LI D M, ZHAO C Y, LIU X R, et al. De novo assembly and characterization of the root transcriptome and development of simple sequence repeat markers inPaphiopedilumconcolor[J]. Genetics and Molecular Research, 2015, 14(2): 6189-6201.

[14] ZENG S, XIAO G, GUO J, et al. Development of a EST dataset and characterization of EST-SSRs in a traditional Chinese medicinal plant,Epimediumsagittatum(Sieb. Et Zucc.) Maxim [J]. BMC Genomics, 2010, 11：94.

[15] DOYLE J J, DOYLE J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue [J]. Phytochemical Bulletin, 1987, 19(1): 11-15.

[16] LIU K, MUSE S V. PowerMarker: an integrated analysis environment for genetic marker analysis [J]. Bioinformatics, 2005, 21(9): 2128-2129.