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        槐葉決明SSR標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用

        2018-03-03 03:33:44劉玉洋葉生月王慧中盧江杰
        浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年2期
        關(guān)鍵詞:槐葉望江南堿基

        劉玉洋,葉生月,閔 會,王慧中*,盧江杰*

        (1.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310036; 2.浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310036; 3.桐廬縣農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化辦公室,浙江 桐廬 311500; 4.浙江康恩貝制藥股份有限公司,浙江 杭州 310052)

        決明屬植物全世界約590種,我國原產(chǎn)約10種,中部、東南部、南部及西南部各省區(qū)均有分布[1]。入藥用的約19種,具清熱明目、潤腸通便的功效,常用來治療便秘、眼病、皮癬、水腫、高血壓和頭痛等病癥。常見以種子入藥的有小決明(CassiatoraL.)、望江南(C.occidentalisL.)和槐葉決明(C.sopheraL.)等[2]。小決明的種子即最常用的中藥“決明子”,目前廣泛用于治療高血脂癥、高血壓,由于瀉下作用緩和又可降脂,成為減肥用品中的最常用組分之一。望江南在醫(yī)藥上常用作緩瀉劑,種子炒后治瘧疾;根有利尿功效;鮮葉搗碎治毒蛇毒蟲咬傷。但有微毒,牲畜誤食過量可以致死,近來關(guān)于望江南中毒病例的報道逐漸增多[3]?;比~決明也稱“茳芒決明”,據(jù)《中藥大辭典》中記載:“茳芒決明,性平,無毒,味甘滑”?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究還表明槐葉決明葉的醇提物有松弛支氣管平滑肌等作用[4-6]。

        民間歷來有望江南代替決明使用的情況,而望江南和槐葉決明由于形態(tài)相似,也?;煊肹2]。所以如何區(qū)分決明屬不同種是中藥質(zhì)量研究的熱點(diǎn)之一。宋賢麗等[7]采用高效毛細(xì)管電泳對決明屬植物種子中的水溶性成分進(jìn)行分析,可以較好地區(qū)分6種決明屬植物。此外,蒽醌類、黃酮類和萜類等化學(xué)成分的化學(xué)指紋圖譜被廣泛應(yīng)用于決明屬植株的研究[8-9]。近年來,DNA分子標(biāo)記也開始在決明屬植物中得到應(yīng)用。如王靜等[10]建立了SRAP分子標(biāo)記體系,可用于決明屬植物的遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定等研究。但是可用的SRAP分子標(biāo)記數(shù)量有限,一定程度上限制了決明屬植物大規(guī)模研究工作的開展。隨著高通量測序技術(shù)被越來越廣泛地應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組分析,通過轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)全基因組SSR分子標(biāo)記,用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、目標(biāo)基因定位以及指紋圖譜繪制等研究成為可能[11]。Jain等[12]在沙棘轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)7.69%的序列含有SSR位點(diǎn),而且平均每6.704 kb就有一個SSR位點(diǎn)。Li等[13]通過同色兜蘭3.77 Gb的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),從3 975條含有SSR位點(diǎn)的序列中獲得4 989對SSR引物。Zeng等[14]從箭葉淫羊藿轉(zhuǎn)錄組序列中隨機(jī)選擇32個SSR分子標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證,其中18對引物可以擴(kuò)增出條帶。目前決明屬的SSR標(biāo)記開發(fā)尚未見報道,本研究通過分析槐葉決明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)方法搜尋SSR位點(diǎn),并設(shè)計SSR標(biāo)記的引物,進(jìn)而利用SSR標(biāo)記分析小決明、望江南和槐葉決明等決明屬材料,以期利用開發(fā)的決明屬SSR分子標(biāo)記進(jìn)行該屬植物的種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析等相關(guān)研究。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        實(shí)驗(yàn)材料為不同地區(qū)收集的1份槐葉決明種子、3份望江南種子和5份小決明種子,具體信息見表1。種子發(fā)芽后,溫室內(nèi)正常培養(yǎng),待植株長到20 cm高后,采集新鮮葉片,液氮冷凍處理后,超低溫保存,用于后續(xù)提取DNA。

        表1 材料編號名稱與產(chǎn)地

        1.2 方法

        1.2.1 基因組DNA的提取與檢測

        DNA提取參考Doyle等[15]的CTAB法,利用超微量紫外分光光度計(NanoUV-3000)進(jìn)行DNA濃度測定。并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度。

        1.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和SSR位點(diǎn)引物設(shè)計

        利用MISA軟件對浙江省藥用植物種質(zhì)改良和質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室擁有的槐葉決明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,按照軟件默認(rèn)參數(shù)鑒定單堿基重復(fù)SSR、雙堿基重復(fù)SSR、三堿基重復(fù)SSR、四堿基重復(fù)SSR、五堿基重復(fù)SSR和六堿基重復(fù)SSR。

        使用軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計。設(shè)計時設(shè)置的主要參數(shù)為:EST序列長度在150 bp以上;引物長度控制在18~25 bp;避免產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)如dimer,hairpin,falseprimer等;CG含量在40%~70%;退火溫度處于45.0~65.0 ℃;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在100~300 bp。引物由上海生工公司合成。

        1.2.3 SSR分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增和引物篩選

        PCR反應(yīng)體系(10 μL)如下:10×PCR Buffer 1 μL,10 mmol·L-1dNTPs 0.3 μL,10 μmol·L-1的正向和反向引物各0.5 μL,2 U·L-1Taq酶0.5 μL,20 ng·μL-1DNA模板1 μL,ddH2O 6.2 μL。PCR反應(yīng)程序如下:94 ℃預(yù)變性3 min,32個循環(huán)(94 ℃變性30 s,各引物退火溫度下復(fù)性40 s,72 ℃延伸90 s),最后72 ℃延伸10 min。選擇2個材料的基因組DNA篩選合成的SSR引物,選出條帶清晰且多態(tài)性好的引物用于后續(xù)所有材料的PCR擴(kuò)增。

        1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳和數(shù)據(jù)分析

        將8%丙烯酰胺40 mL,10%過硫酸銨280 μL,TEMED 26 μL,混合均勻后水平灌膠,插上68孔梳子,水平放置直至膠凝固(30 min左右)。在電泳槽中加入適量1×TBE緩沖液,上樣,在200 V電壓下電泳分離2 h。電泳結(jié)束后,用蒸餾水將凝膠漂洗2 min后,置入800 mL 0.1%的AgNO3溶液中染色25 min(期間使用搖床搖動);之后在蒸餾水中漂洗2次,每次10 s。將漂洗之后的凝膠放入含有800 mL 1%的氫氧化鈉溶液中(含2 mL甲醛)顯影,搖床搖動直至凝膠上出現(xiàn)清晰的條帶。用蒸餾水漂洗10 s。

        使用BIO-RAD visadoc 3.0(Bio-RAD,USA)成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠掃描后,通過Quantity One軟件依據(jù)DNA Marker計算每個條帶的分子量大小,并依據(jù)SSR標(biāo)記的預(yù)計大小和重復(fù)單元進(jìn)行矯正,確定等位變異大小(bp)和數(shù)量,由軟件PowerMarker version 3.25[16]進(jìn)行遺傳豐富度(A)和多態(tài)信息量(PIC)等多樣性指數(shù)計算。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 槐葉決明轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)分布特點(diǎn)

        利用MISA軟件對拼接得到的103 305條槐葉決明unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索,共檢測到15 753個SSR位點(diǎn),可用于標(biāo)記開發(fā)。如表2所示,單堿基重復(fù)數(shù)SSR位點(diǎn)數(shù)占39.55%,其中以A/T占比最大(38.51%);雙堿基重復(fù)數(shù)占27.40%,其中AG/CT占9.36%;三堿基重復(fù)數(shù)占30.84%,其中AAG/CTT占9.36%;四堿基重復(fù)數(shù)占1.44%,其中AAAG/CTTT占0.37%;五堿基重復(fù)數(shù)占0.23%,其中AAAAG/CTTTT占0.03%;六堿基重復(fù)數(shù)占0.53%,其中AAGAGG/CCTCTT占0.01%。

        2.2 SSR分子標(biāo)記開發(fā)和驗(yàn)證

        對15 753個SSR位點(diǎn)利用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計,最終有10 110個SSR位點(diǎn)可以設(shè)

        表2 槐葉決明轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)各類型的情況

        計SSR引物。隨機(jī)選擇50對SSR引物由上海生工合成,通過PCR擴(kuò)增,聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳,銀染,拍照,經(jīng)初步篩選得到25對條帶清晰、有差異的SSR引物可用于后續(xù)不同產(chǎn)地槐葉決明遺傳多樣性分析。這些標(biāo)記的等位基因數(shù)量從2到7不等,平均有2.72個等位基因;遺傳豐富度從0.20到0.73不等,平均為0.45;PIC從0.18到0.70不等,平均為0.39(表3)。圖1為SSR引物CPtSSR008在不同試驗(yàn)材料中的電泳結(jié)果。

        表3 本研究中用于遺傳多樣性分析的25對SSR分子標(biāo)記信息

        1~9分別表示本研究中使用的決明屬種質(zhì)資源材料,與表1相同。M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量圖1 引物CPtSSR008的電泳結(jié)果

        2.3 不同決明屬材料的遺傳多樣性分析

        根據(jù)25對SSR引物電泳結(jié)果,通過聚類距離比較分析發(fā)現(xiàn):槐葉決明和不同產(chǎn)地決明子、不同產(chǎn)地決明子之間遺傳距離在0.111~0.963,其中槐葉決明、小決明和望江南各種之間,以及小決明和望江南不同地理來源之間均存在較大遺傳差異(表4)。

        進(jìn)一步通過遺傳聚類分析,我們發(fā)現(xiàn)槐葉決明、小決明和望江南可分為三類:槐葉決明為第一類;河北、安徽、北京產(chǎn)地的望江南為第二類;四川、廣西、廣東、甘肅、河南產(chǎn)地的小決明為第三

        表4 各材料的遺傳距離

        類(圖2)。從種子外觀上看,槐葉決明種子與決明差異較大,這與利用SSR分子標(biāo)記鑒定的結(jié)果一致,而不同產(chǎn)地的槐葉決明和望江南材料無論種子還是植株根莖葉差異都不大,很難從外觀上鑒定出不同,利用SSR分子標(biāo)記技術(shù),我們鑒定出了槐葉決明和不同產(chǎn)地望江南的差異,從而為槐葉決明和望江南的種質(zhì)資源分析鑒定提供依據(jù)。

        圖2 基于SSR分子標(biāo)記的決明屬遺傳聚類

        3 小結(jié)與討論

        通過分析槐葉決明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),本研究共發(fā)掘了15 753個SSR位點(diǎn),并成功設(shè)計出10 110對SSR引物。隨機(jī)選取其中的50對SSR引物中,有電泳條帶清晰和多樣性高的SSR引物25對,可用于本實(shí)驗(yàn)室收集的決明屬材料遺傳多樣性分析以及種質(zhì)資源鑒定。因此,我們預(yù)計本研究共開發(fā)決明屬SSR標(biāo)記5 000個左右。而且這些標(biāo)記可為槐葉決明、小決明和望江南3個種為代表的決明屬材料相關(guān)研究提供分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫。

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