宋 振 ，宋三平，凃 政 ，趙 杰 ，賀永鋒,

（1. 陜西省公安廳刑偵局，西安 710018；2. 公安部物證鑒定中心，北京 100038）

骨骼和牙齒的組織結(jié)構(gòu)可有效保護(hù)骨細(xì)胞與牙釉質(zhì)，故而能抵抗外界環(huán)境因素的影響[1]。因此，對高度腐敗及白骨化的尸體進(jìn)行尸源鑒定，從骨骼和牙齒中提取DNA并進(jìn)行STR分型檢驗(yàn)是可賴以利用的重要技術(shù)手段。但傳統(tǒng)脫鈣法存在提取時間長、有機(jī)純化試劑有毒、得到的DNA濃度低及易于污染等缺點(diǎn)[2-4]，特別是當(dāng)檢材為陳舊骨骼、牙齒時其提取成功率就更低。本文利用Handy-Eco儀器和Freezer Mill冷凍研磨儀結(jié)合King fi sher自動化提取系統(tǒng)，提取骨骼和牙齒DNA，研究其對法醫(yī)學(xué)檢案的可應(yīng)用性。

1 材料與方法

1.1 檢材來源

本實(shí)驗(yàn)室日常檢案積累的380例骨骼、牙齒檢材，分成常規(guī)和疑難兩組：常規(guī)組包括347例骨骼、牙齒檢材（保存年限：2年以內(nèi)）；疑難組包括33份陳舊骨骼、牙齒檢材（其中8份為陳舊骨骼、最長保存年限46年；25份為牙齒、保存年限最長者22年）。

1.2 主要儀器與試劑

9700型PCR擴(kuò)增儀、3500型遺傳分析儀、Identi fi lerPlus試劑盒(Life公司)；骨骼專用磁珠法DNA提取試劑盒（長春博坤公司，King fi sher提取儀專用）；Handy-Eco儀器（韓國世洋公司）；6770-230Freezer-Mill冷凍研磨儀(SPEXSamplePrep公司)；King fi sher自動化提取系統(tǒng)(Thermo公司)。

1.3 檢材預(yù)處理

1.3.1 常規(guī)組骨骼、牙齒預(yù)處理（保存2年以內(nèi)）

取常規(guī)骨骼或牙齒檢材，用手術(shù)刀刮凈表面，清洗，晾干，以5 %次氯酸鈉溶液處理15 min，蒸餾水清洗3～4次，無水乙醇浸泡一次，除去殘余水分，紫外燈下照射20 min。將上述檢材用Handy-Eco儀器研磨成粉，取50～150 mg，備用。

1.3.2 疑難組骨骼（牙齒）預(yù)處理（保存2年～46年）

骨骼與牙齒的前處理同1.3.1常規(guī)組。處理完畢后，陳舊骨骼檢材在完整股骨頭一端取4～6塊(1～2 g/塊)骨碎片；陳舊牙齒檢材選取整個牙齒。將上述檢材用6770-230 Freezer Mill冷凍研磨儀振蕩研磨至粉末狀，備用。

1.4 檢材DNA提取

1.4.1Handy -EcoKing fi sher 法（H-K法）

1）按上述處理的常規(guī)組，每份取粉末約50 mg，置于1.5 mL離心管中，加入骨骼專用磁珠法DNA提取試劑盒的裂解液350μL、蛋白酶K(20 mg/mL)20μL、1mol/L DTT 20μ L(新 鮮 配 制 )；2） 在56℃恒溫金屬?。‥ppendorf公司）混勻(750 r/min低轉(zhuǎn)數(shù)震蕩)并孵育過夜；3）10 000 g離心10 min，取上清液用King fi sher自動化系統(tǒng)提取骨粉DNA，模板DNA最終洗脫體積20μ L。

1.4.2H-K法優(yōu)化比較

選取常規(guī)組中同一個體的骨粉和牙粉、疑難組中22年的骨粉（對照），按上述H-K方法提取DNA，并分別設(shè)置不同樣本量(50、100、150 mg)及不同消化時間(6、18 h)，以選擇確定最佳樣本量和消化時間。

1.4.3Freeze -millKing fi sher 法(FM-K法)

1）取8份已處理好的陳舊骨骼粉末各約5 g，已處理好的25顆陳舊牙齒粉末各約1.5 g，于15 mL離心管中加入骨骼專用磁珠法DNA提取試劑盒裂解液5 mL、蛋白酶 K (20 mg/mL) 200 μ L、1 mol/L DTT 200 μL(新鮮配制)；2）56 ℃恒溫金屬?。‥ppendorf公司）混勻(750 r/min低轉(zhuǎn)數(shù)震蕩)并孵育過夜；3）按前量補(bǔ)加DTT和蛋白酶K；4）再次重復(fù)（2）的處理操作；5）10000 g 離心10 min；6）取上清液用King fi sher自動化系統(tǒng)富集所提取的骨粉及牙粉DNA，模板DNA最終洗脫體積15 μL。

1.5 STR分型檢測

用Identi fi ler Plus試劑盒進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，反應(yīng)總體積10 μL，其中 DNA 模板4 μ L。反應(yīng)條件：95 ℃、11 min；94 ℃、20 s；59 ℃、3min；60 ℃、10 min；循環(huán)數(shù)30。PCR產(chǎn)物在3500遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，GeneMapper ID-X V1.4軟件對電泳數(shù)據(jù)做分析。

2 結(jié)果

2.1 H-K法提取常規(guī)組骨骼、牙齒DNA的結(jié)果

H-K法提取DNA結(jié)果見表1。由表可見，保存時間在2年內(nèi)、不同保存環(huán)境的常規(guī)組檢材采用H-K法提取成功率達(dá)到99.42 %（成功獲得15個STR分型結(jié)果）。

表1 H-K法提取DNA結(jié)果Table 1 DNA Extracted by H-K processing

2.2 H-K法優(yōu)化后提取DNA的結(jié)果

按本文1.4.2項(xiàng)選取檢材以及同樣的條件與操作進(jìn)行分組并檢驗(yàn)，所得 STR分型結(jié)果見表2?？梢?，隨著消化時間的延長和消化骨粉、牙粉量的增加，STR檢驗(yàn)的成功率也在增加。因此，對于常規(guī)的骨骼、牙齒檢材，選用100 mg骨粉或牙粉量、消化時間18 h，就可基本上成功獲得STR分型結(jié)果。但對于22年的陳舊檢材，H-K法檢測成功率為0，全部檢測失敗。

表2 H-K法在不同優(yōu)化條件下提取DNA結(jié)果比較Table 2 Comparison of DNA extracted by H-K processing under different optimal conditions

2.3 FM-K法提取疑難組骨骼牙齒DNA的結(jié)果

FM-K法提取DNA結(jié)果見表3。疑難組骨骼和牙齒樣本采用FM-K法提取成功率達(dá)到96.97 %（成功獲得12個STR結(jié)果以上，具備比對條件）和90.91 %（成功獲得15個STR分型結(jié)果）。

表3 FM-K法提取DNA結(jié)果Table 3 DNA Extracted by FM-K processing

2.4 案例應(yīng)用

2010年12月，榆林某地發(fā)生一起配陰婚盜尸案，嫌疑人盜取埋在地底下46年的一具女性遺骸。遺骸追回后，需做DNA進(jìn)行親緣關(guān)系比對。采用本文1.4.3FM-K法提取DNA，成功獲得了STR分型結(jié)果(圖1)，為尸源認(rèn)定提供了重要依據(jù)。

1993年5月29日，在蒲城縣某一小煤窯井口附近，南某因開煤窯的瑣事與王某發(fā)生爭執(zhí)而被打傷，后死亡，王某在逃。2015年8月18日，王某歸案，需確定22年前受害人南某的身份，開棺提取脛骨一份，采用本文1.4.3FM-K法提取DNA，成功獲得了STR分型結(jié)果(圖2)。

圖2 22年陳舊骨骼STR分型結(jié)果Fig.2 STR typing from a 22-year bone

3 討論

目前，骨骼、牙齒DNA檢驗(yàn)已成為法醫(yī)DNA檢驗(yàn)鑒定的常規(guī)技術(shù)[5]，采用脫鈣法等傳統(tǒng)手段檢驗(yàn)，雖然對較為新鮮的骨骼、牙齒成功率能達(dá)到97.92%（96例檢材中94例成功）[6-7]，但對于陳舊的骨骼、牙齒成功率卻相對較低，且存在耗時長、所用有機(jī)試劑毒性大、出峰不均衡等缺點(diǎn)[8]。本文利用Handy-Eco儀器和冷凍研磨儀研磨骨骼、牙齒，結(jié)合King fi sher自動化提取設(shè)備和骨骼專用磁珠法DNA提取試劑盒，使骨骼和牙齒的DNA提取成功率達(dá)到99.42 %（常規(guī)骨骼牙齒類）和96.97 %（疑難骨骼牙齒類）。

筆者認(rèn)為，對日常檢案中遇到的大部分常規(guī)類型骨骼、牙齒檢材，由于通常其保存時間不超過2年，保存環(huán)境也相對較好，這類檢材可用H-K法處理，消化需要的骨粉、牙粉量少，省時省力，STR檢出成功率也很高。另外，H-K法所用Handy-Eco儀器與普通電鉆相比，還具有以下優(yōu)點(diǎn)：一是Handy-Eco打磨工具功率相對較低，轉(zhuǎn)速相對較慢，故震動頻率就相對較低，摩擦力較小，不易產(chǎn)生過量熱能；二是Handy-Eco打磨工具易控制轉(zhuǎn)速，操作簡單，穩(wěn)定性好，便于單手掌握；三是Handy-Eco打磨工具的轉(zhuǎn)頭小巧輕便，易更換，一物證一轉(zhuǎn)頭，能防污染，經(jīng)濟(jì)成本低；四是經(jīng)過Handy-Eco打磨工具處理過的骨粉或者牙粉比較細(xì)膩，有利于下一步的消化。

本文所有檢材均來自于日常檢案，故所討論的H-K法也是因工作實(shí)際需要而建立，后來逐步優(yōu)化。對于常規(guī)骨骼檢材，取材量50 mg和消化6 h的條件并不能獲得理想的STR分型結(jié)果，但適當(dāng)增加取材量（100 mg）及延長消化時間（18 h，低轉(zhuǎn)數(shù)震蕩過夜）后，便可有效提高提取成功率。當(dāng)然，取材時需選用完整性相對較好的骨松質(zhì)和骨密質(zhì)。對于牙齒檢材，磨牙粉時需磨到牙髓處。另外，在DNA擴(kuò)增階段適當(dāng)增加PCR循環(huán)數(shù)，也可提高擴(kuò)增成功率[2]。

對于疑難骨骼、牙齒檢材，比如時間過久，保存環(huán)境惡劣，檢材量非常少的情況，使用H-K法的成功率基本上為零（見表2），此時可考慮直接選用FM-K法，因?yàn)椋?）在超低溫環(huán)境下打磨骨骼、牙齒，有利于最大程度地保護(hù)其中的DNA；2）消化時骨粉用量比較大，其中的骨細(xì)胞含量相對增加，在一定程度上提高了檢測成功率；3）FM-K法與傳統(tǒng)脫鈣法相比，提取時間短，操作步驟少，實(shí)驗(yàn)周期緊湊，自動化程度高，污染風(fēng)險也低[9]；4）King fi sher自動化提取系統(tǒng)能將大量的裂解液進(jìn)行富集，且最小洗脫體積仍可達(dá)到15 μ L，獲得的DNA濃度和純度均較高。

綜上所述，本文提取骨骼牙齒DNA的方法，操作步驟簡單，使用常規(guī)試劑，成本低，成功率高，適于基層法醫(yī)對陳舊骨骼、牙齒中的DNA進(jìn)行檢驗(yàn)。

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