付翠群，丁西平，沈國(guó)棟，侯冠峰，戴朦，沈干，胡世蓮

[中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)，安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所，腫瘤免疫與營(yíng)養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽省循證醫(yī)學(xué)中心，合肥 230001]

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)胃癌發(fā)病率與致死率在惡性腫瘤中均居前列，嚴(yán)重危害人類健康[1]。早期胃癌經(jīng)外科手術(shù)和藥物化療可治愈，但是我國(guó)大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已經(jīng)是晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)期。對(duì)于晚期胃癌患者，化療是其最主要的治療方法，然而很多患者對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐受，導(dǎo)致化療結(jié)果不理想，降低患者的生存質(zhì)量和生存年限。因此，尋找與胃癌化療耐藥相關(guān)的分子標(biāo)記物，對(duì)胃癌的化學(xué)治療有很重要的臨床意義。已有研究顯示W(wǎng)nt通路在結(jié)腸癌與乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中呈活化狀態(tài)，其中轉(zhuǎn)錄因子7類似物2(TCF7L2)是該信號(hào)通路中關(guān)鍵的下游靶基因之一[2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)TCF7L2的研究主要在糖尿病和乳腺癌方面，在胃癌中的表達(dá)情況尚無研究，本研究主要研究TCF7L2在胃癌中的表達(dá)情況及其與胃癌化療耐藥的關(guān)系。如果TCF7L2在胃癌中異常高表達(dá)，并與胃癌的化療耐藥存在相關(guān)性，為日后胃癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)，提高胃癌化療患者的存活率。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)GIBCL公司)；TCF7L2 兔mAb、β-actin 兔 mAb、抗兔IgG(美國(guó)CST公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；蛋白磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑混合物(瑞士Roche公司)；顯影液(上海天能科技有限公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)RNeasy mini Kit(德國(guó)Qiagen GmbH,Hilden公司)；High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(美國(guó)生命技術(shù)公司)；引物TCF7L2、β-actin(日本TaKaRa Clon Tech公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臨床標(biāo)本獲取 人胃癌組織和胃癌旁組織均取自安徽省立醫(yī)院普外科胃癌患者手術(shù)切除的組織中，其中胃癌組織最后病理結(jié)果均為腺癌，胃癌旁組織取距離癌巢≥2 cm遠(yuǎn)處。在無菌的環(huán)境下取組織標(biāo)本，用無菌0.9%氯化鈉注射溶液將組織清洗，并剔除脂肪組織，獲得最終本研究需要的組織，總共收集15例胃癌患者的胃癌組織和胃癌旁正常組織。標(biāo)本的獲取及其用途經(jīng)患者本人知情同意，所有標(biāo)本僅用于科研實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染24 h前，在30 mm培養(yǎng)皿中接種適量密度的SGC7901細(xì)胞(約2×105/mL)，待細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)50%～80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。配制溶液1∶240 μL無血清培養(yǎng)基+10 μL LP2000，室溫孵育5 min；溶液2∶250 μL無血清培養(yǎng)基+2 μg TCF7L2表達(dá)質(zhì)粒，室溫孵育5 min；將溶液1與溶液2混合，室溫下放置20 min；將6孔板中的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞兩遍后，加入2 mL無血清培養(yǎng)基；將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻；置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中保溫4～6 h；更換含有血清的全培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將六孔板中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化成單細(xì)胞懸液，按照每孔一個(gè)細(xì)胞比例稀釋后加入96孔板，并加入適量purocymin進(jìn)行篩選，最終獲得knock-in TCF7L2 的SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞和對(duì)照組SGC-7901/CON細(xì)胞株[3]。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株分別在含10 %小牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)基、37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)[4]。

1.2.4 免疫印跡檢測(cè) 應(yīng)用RIPA裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑混合物制成的混合物裂解細(xì)胞提取蛋白和組織蛋白，具體實(shí)驗(yàn)步驟見說明書；應(yīng)用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液，于100 ℃水中煮沸5～10 min，冰上冷卻上樣；取出凝膠常規(guī)轉(zhuǎn)膜后在5%的脫脂奶中封閉2 h，加1∶1000稀釋的β-actin Rabbit mAb，搖床搖蕩孵育4 ℃過夜，PBST漂洗過后將膜與HRP結(jié)合的二抗(Anti-Rabbit IgG)1∶1000稀釋室溫?fù)u蕩孵育2 h[5-6]。然后用PBST充分洗膜后將顯影液加于PVDF膜上，在顯影儀上顯影。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR 應(yīng)用RNeasy mini Kit試劑盒提取RNA，具體步驟見該試劑盒說明書；核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定抽提RNA的濃度，根據(jù)High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit說明書操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；以cDNA為模板，擴(kuò)增TCF7L2片段，選β-actin作為內(nèi)參[7-8]。引物序列：TCF7L2上游為AAACAGGAATCGTCCCAGAGTG，下游為CTCAGCTACGACCTTTGCTCTCA；β-actin上游為TTG CCG ACA GGA TGC AGA A，下游為GCC GAT CCA CAC GGA GTA CTT,結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，采用2-△△Ct進(jìn)行表示。

1.2.6 耐藥實(shí)驗(yàn) 收集SGC-7901/CON及SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株,分別制成濃度為10×104/mL的單細(xì)胞懸液,接種6孔板,每孔2 mL。分別加入5種不同濃度的化療藥物，即順鉑(DDP,0.01、0.1、1、10、100 μmol/L),卡鉑(DBP,0.01、0.1、1、10、100 μmol/L)，每個(gè)藥物濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔，另設(shè)2個(gè)復(fù)孔不加藥物作為空白對(duì)照組。37 ℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)48 h[9]。用PBS洗2次，用500 μL的0.25%胰酶消化10 min，再加入500 mL PBS,用1 mL移液槍吹打均勻，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，結(jié)果取用2復(fù)孔的均值進(jìn)行表示。

1.2.7 免疫組織化學(xué) 將由甲醛固定、石蠟包埋后的切片行2 μm連續(xù)切片，經(jīng)免疫組織化學(xué)SP法:在電烘箱內(nèi)以60 ℃的條件烘烤10～20 min后，放入二甲苯中脫蠟以及梯度酒精中脫水，在枸櫞酸(pH7.2)溶液中通過高溫高壓的方式進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，經(jīng)3%的過氧化氫溶液清除內(nèi)源性氧化酶，用山羊血清室溫封閉30 min，棄去，加入TCF7L2抗體工作液(1∶150)4 ℃過夜，次日經(jīng)PBS(pH 7.2)洗凈后，二抗孵育1 h，DAB染色劑，染色時(shí)間控制在6 min以內(nèi)，清水終止，放入蘇木精中復(fù)染，最后進(jìn)行梯度酒精二甲苯脫水透明化，進(jìn)行封片，并在顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件分析數(shù)據(jù)，多組樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSDt檢驗(yàn)，方差不齊者采用Games Howell檢驗(yàn)。兩組獨(dú)立樣本的比較，數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布者采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布者采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中的TCF7L2表達(dá)量明顯高于癌旁組織 共收集15例患者胃癌組織和胃癌旁組織，并對(duì)其進(jìn)行研究。如圖1所示，15例患者胃癌組織中的TCF7L2 mRNA量明顯高于胃癌旁組織(P=0.001)。

TU：胃癌組織，NT:胃癌癌旁組織

2.2 胃癌細(xì)胞株中TCF7L2高表達(dá) 選取6個(gè)胃癌細(xì)胞株(SGC-7901、HSC44、44AS3、N87、MKN45、MGC803)和一個(gè)人正常胃黏膜細(xì)胞株(GES-1)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示與正常細(xì)胞株相比TCF7L2基因在胃癌細(xì)胞株均異常高表達(dá)，但是表達(dá)的量因細(xì)胞株不同的而不同，其中SGC-7901細(xì)胞株TCF7L2的表達(dá)量最低，44AS3細(xì)胞株表達(dá)量最高(見圖2)。

圖2 人胃癌細(xì)胞株western blot結(jié)果

2.3 SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株中TCF7L2表達(dá) 選取TCF7L2表達(dá)最低的細(xì)胞株SGC-7901經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得SGC-7901/TCF7L2和SGC-7901/CON(對(duì)照組)兩細(xì)胞株。SGC-7901/TCF7L2中TCF7L2 mRNA的量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.029；SGC-7901/TCF7L2中TCF7L2蛋白表達(dá)量也明顯高于對(duì)照組(見圖3)。

A:細(xì)胞株qRT-PCR結(jié)果圖;B:細(xì)胞株western blot結(jié)果圖；a:SGC-7901/CON細(xì)胞株，b：SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株；與SGC-7901/CON比較，cP<0.05

圖3SGC-7901/CON細(xì)胞株和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株qRT-PCR、western blot結(jié)果

2.4 SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株對(duì)鉑類的耐藥性 分析顯示順鉑對(duì)SGC-7901/CON細(xì)胞株和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株的IC50值分別是2.85 μmol/L和12.21 μmol/L，與SGC-7901/CON細(xì)胞株相比較，SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株對(duì)順鉑的耐藥性是4.28倍，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)；卡鉑對(duì)SGC-7901/CON細(xì)胞株和SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株的IC50值分別是2.82 μmol/L和5.81 μmol/L，與SGC-7901/CON細(xì)胞株相比較，SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株對(duì)順鉑的耐藥性是2.06倍，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)(見圖4)。

3 討論

有研究[10]顯示W(wǎng)nt信號(hào)通路與腫瘤化療耐藥有關(guān)。在胃癌的發(fā)展過程中Wnt信號(hào)異常激活，包括Wnt表達(dá)的頻率上調(diào)[11]，以及β-catenin/TCF4的核異位現(xiàn)象，初步確認(rèn)了Wnt通路參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展[12]。TCF7L2是TCF家族的一員，是Wnt通路中最為重要的下游轉(zhuǎn)錄因子[13-14]。當(dāng)Wnt信號(hào)通路異常激活時(shí)，未被降解的β-catenin進(jìn)入核內(nèi)，與TCF7L2的相關(guān)結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，并與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合使下游靶基因過度表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15-16]。因此，TCF7L2基因在胃癌中是否異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展可能存在相關(guān)性。

A：細(xì)胞株對(duì)順鉑耐藥實(shí)驗(yàn)；B：細(xì)胞株對(duì)卡鉑耐藥實(shí)驗(yàn)；與SGC-7901/CON比較，aP<0.05

圖4TCF7L2基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物耐藥性的影響

研究結(jié)果顯示，TCF7L2基因和蛋白在同一患者胃癌組織中的表達(dá)量明顯高于其胃癌旁組織中的，TCF7L2蛋白在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)較正常胃細(xì)胞株明顯增高。選取TCF7L2表達(dá)最低的細(xì)胞株SGC-7901經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得SGC-7901/CON和SGC-7901/TCF7L2兩細(xì)胞株，SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株的TCF7L2基因較對(duì)照組的明顯上調(diào)，細(xì)胞耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SGC-7901/TCF7L2細(xì)胞株對(duì)鉑類的耐藥性明顯強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞株。因此，TCF7L2基因在胃癌細(xì)胞株中異常高表達(dá)，TCF7L2能夠增強(qiáng)胃癌細(xì)胞株對(duì)鉑類化療藥物的耐受性。

本研究證實(shí)，TCF7L2與胃癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，它能增強(qiáng)胃癌細(xì)胞株對(duì)鉑類化療藥物的耐受性。細(xì)胞耐藥實(shí)驗(yàn)證實(shí)TCF7L2表達(dá)增強(qiáng)胃癌細(xì)胞株對(duì)鉑類化療藥物的耐受性，其機(jī)制目前尚未明確。有研究[17]顯示，可能與TCF7L2異常高表達(dá)促進(jìn)下游腫瘤細(xì)胞干性標(biāo)志物基因過表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞干性導(dǎo)致胃癌細(xì)胞株對(duì)鉑類化療藥物耐受，確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究中發(fā)現(xiàn)TCF7L2基因的高表達(dá)將增強(qiáng)胃癌細(xì)胞株對(duì)鉑類的耐藥性這一現(xiàn)象，為下一步深入研究TCF7L2增強(qiáng)胃癌細(xì)胞株對(duì)鉑類耐藥性的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)和方向，TCF7L2有可能成為靶向治療的新靶點(diǎn)。

[1] BERT V,NICKOLAS P,VELCULESCU VE,et al.Cancer genome landscapes.[J].Science,2013,339(6127):1546-1558.

[2] WANG F,JIANG L,LI J,et al.Association between TCF7L2 polymorphisms and breast cancer susceptibility:a meta-analysis[J].Inter J Clin Exp Med,2015,8(6):9355-9361.

[3] CHONG C,FENGQI C,LIPENG B,et al.IKKβ enforces a LIN28B/TCF7L2 positive feedback loop that promotes cancer cell stemness and metastasis[J].Cancer Res,2015,75(8):1725-1735.

[4] JU X,ISHIKAWA TO,NAKA K,et al.Context-dependent activation of Wnt signaling by tumor suppressor RUNX3 in gastric cancer cells[J].Cancer Sci,2014,105(4):418-424.

[5] SHAFER SL,TOWLER D.Transcriptional regulation of SM22α by Wnt3a:Convergence with TGFβ1/Smad signaling at a novel regulatory element[J].J Mol Cell Cardiol,2009,46(5):621-635.

[6] XIN T,LI LL,LI XY,et al.SOX10,a novel HMG-box-containing tumor suppressor,inhibits growth and metastasis of digestive cancers by suppressing the Wnt/β-catenin pathway[J].Oncotarget,2014,5(21):10571-10583.

[7] GUDRUN M,SANDRA H,PETER H,et al.Wnt-dependent T-cell factor-4 controls human etravillous trophoblast motility[J].Endocrinology,2014,155(5):1908-1920.

[8] MEERA S,RENNOLL SA,RAUP-KONSAVAGE WM,et al.A dynamic exchange of TCF3 and TCF4 transcription factors controls MYC expression in colorectal cancer cells[J].Cell Cycle,2015,14(3):323-332.

[9] GUO P,PENG DX,XIONG XP,et al.Expression of microRNA-100 and its correlation with drug resistance in human ovarian cancer SKOV3/DDP cells[J].J South Med Univ,2015,35(11):1624-1627.

[10] YUAN G,REGEL I,LIAN F,et al.WNT6 is a novel target gene of caveolin-1 promoting chemoresistance to epirubicin in human gastric cancer cells[J].Oncogene,2012,32(3):375-387.

[11] QI Y,GUANGMIN Y,MENGKE Z,et al.A novel ent-kaurane diterpenoid executes antitumor function in colorectal cancer cells by inhibiting Wnt/β-catenin signaling[J].Carcinogenesis,2015,36(3):318-326.

[12] ZHOU Y,LAN J,WANG W,et al.ZNRF3 acts as a tumour suppressor by the Wnt signalling pathway in human gastric adenocarcinoma[J].J Mol Histol,2013,44(5):555-563.

[13] CHEN ZL,SHAO WJ,XU F,et al.Acute Wnt pathway activation positively regulates leptin gene expression in mature adipocytes[J].Cell Signal,2015,27(3):587-597.

[14] YU XW,XU Q,XU Y,et al.Expression of the E-cadherin/β-catenin/tcf-4 pathway in gastric diseases with relation to Helicobacter pylori infection:clinical and pathological implications[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(1):215-220.

[15] SRIVASTAVA R,ZHANG J,GO GW,et al.Impaired LRP6-TCF7L2 activity enhances smooth muscle cell plasticity and causes coronary artery disease[J].Cell Reports,2015,13(4):746-759.

[16] ZHAO CT,DENG YP,LIU L,et al.Dual regulatory switch through interactions of Tcf7l2/Tcf4 with stage-specific partners propels oligodendroglial maturation[J].Nat Commun,2016,9(7):1-15.

[17] YAMAKAWA-KARAKIDA N,SUGITA K,INUKAI T,et al.Ligand activation of peroxisome proliferator-activated receptor γ induces apoptosis of leukemia cells by down-regulating the c-myc gene expression via blockade of the Tcf-4 activity[J]. Cell Death Differ,2002,9(5):513-526.