張明敏，杜建文（.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)55000；.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院急診科，貴州貴陽(yáng) 55000）

急性重癥胰腺炎（SAP）起病迅速，發(fā)展快，并發(fā)癥嚴(yán)重，預(yù)后不良，病死率高，近年來(lái)，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道其發(fā)病率為10%～30%[1-2]。一直以來(lái)，SAP均是急腹癥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，對(duì)于SAP的發(fā)病原因也在不斷探索中。本實(shí)驗(yàn)以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，對(duì)臨床治療SAP的經(jīng)典方劑——大承氣湯進(jìn)行研究。大承氣湯來(lái)自仲景的《傷寒論》，其組方（大黃、厚樸、枳實(shí)、芒硝）簡(jiǎn)單而精妙。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射L-精氨酸方法造模，對(duì)造模成功的SD大鼠進(jìn)行口腔灌胃大承氣湯，股動(dòng)脈采血并開腹取胰腺組織進(jìn)行相關(guān)血清學(xué)及胰腺腺泡細(xì)胞凋亡分析，觀察大鼠血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）、可溶性白細(xì)胞介素-2受體（sIL-2R）水平變化對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的影響，探討大承氣湯治療SAP的可能作用機(jī)制，特別是對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的作用，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般材料 采用成年SD大鼠66只，均為雌性，大鼠平均體重為（230±20）g，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給。許可證號(hào)：scxk（川）2016-09。按照隨機(jī)數(shù)字表法、完全隨機(jī)分組法將66只大鼠分為空白組、模型組、大承氣湯組，其中空白組6只，模型組和大承氣湯組各30只。模型組及大承氣湯組分別再按時(shí)間點(diǎn) 2、6、12、24、48 h 進(jìn)行分組，每組 6 只。在造模成功后分別將模型組和大承氣湯組大鼠按照對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死并進(jìn)行分批股動(dòng)脈取血及手術(shù)取胰腺組織。空白組大鼠于腹腔注射生理鹽水后3 h采樣，模型組造模成功后不再灌胃大承氣湯。

1.1.2 試劑及儀器 主要試劑：L-精氨酸（索萊寶公司）；生理鹽水（科倫藥業(yè)股份有限公司）；大承氣湯（北京同仁堂）。中藥煎藥機(jī)（恒延鑫密閉壓榨煎藥機(jī)）由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院提供；12號(hào)灌胃針頭；主要酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒：IL-6、sIL-2R由伊來(lái)瑞特生物科技有限公司提供，產(chǎn)品編號(hào)：E-EL-R0015c。凋亡試劑盒（美國(guó)BD公司，貨號(hào)：551302，規(guī)格：MITOSCREEN JC-1 KIT 100TST）由成都百態(tài)生物科技有限公司提供。流式細(xì)胞儀由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室研究平臺(tái)提供（藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)不禁食、禁飲5 d后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)造模，空白組6只大鼠不做處理，造模前24 h禁食、禁飲。模型組及大承氣湯組分別進(jìn)行SAP造模，采用腹腔注射L-精氨酸方法進(jìn)行造模，用生理鹽水配置，pH值為7.0腹腔注射制作大鼠SAP模型，采用1.148 mmol/L（10%）L-精氨酸溶液，每次 3.0 mg/g，1 h 后重復(fù)注射1次，3 h后即為造模成功[3]。模型組與大承氣湯組造模方法相同?？瞻捉M：采用等量生理鹽水腹腔注射。

1.2.2 給藥方法及試劑 藥物：（1）方劑采用《方劑學(xué)》5版教材劑量。大承氣湯：大黃12 g，芒硝9 g，枳實(shí)12 g，厚樸15 g。（2）大承氣湯煎劑制作：先將中藥用清水浸泡 2 h，再用煎藥機(jī)煎 2 h，煎成每劑 200 mL。（3）大承氣湯組所有大鼠均采用口腔灌胃的方法給藥，于造模成功后3 h灌胃，采用12號(hào)灌胃針頭及中藥濃度為43.2%的大承氣湯溶液（劑量按人與大鼠體表面積換算，即100 mL 溶液中含大承氣湯 43.2 g）灌胃（1 mL/200 g）[4]。（4）模型組采用等量生理鹽水灌胃。各組SD大鼠灌胃每次均 12 h，在 2、6、12、24、48 h 分批處死 6 只 SD 大鼠并采集血清及胰腺組織。

1.2.3 標(biāo)本采集 空白組大鼠于腹腔注射生理鹽水后3 h采樣，模型組及大承氣湯組大鼠于造模成功后2、6、12、24、48 h采樣。采樣方法：斷頭處死后，股動(dòng)脈取血及時(shí)進(jìn)行離心、分離，取上層血清，并立即于-80℃低溫冰箱保存血清，以便檢測(cè)IL-6、sIL-2R水平；立即開腹取出胰腺組織，將取出的胰腺組織立即保存于液氮中，以便進(jìn)行細(xì)胞懸液制備，檢測(cè)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 血清IL-6、sIL-2R水平測(cè)定 依據(jù)大鼠的標(biāo)記號(hào)及相應(yīng)分組，對(duì)分離所得血清采用ELISA檢測(cè)IL-6、sIL-2R水平，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.5 胰腺腺泡細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將液氮保存的胰腺組織用眼科剪將組織細(xì)胞分離，進(jìn)行細(xì)胞懸液的制備。采用Annexin V法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，凋亡的胰腺腺泡細(xì)胞定量用BD凋亡細(xì)胞試劑盒檢測(cè)，且嚴(yán)格按BD公司凋亡試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將Annexin-V進(jìn)行熒光素藻紅蛋白（PE）標(biāo)記，以標(biāo)記了Annexin-V作為熒光探針，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以x±s表示，各組間同一指標(biāo)比較采用單因素ANOVA方差分析，同組內(nèi)同一指標(biāo)治療前后變化比較采用自身配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組各時(shí)間點(diǎn)血清IL-6、sIL-2R水平比較 大承氣湯組及模型組大鼠組內(nèi)2、6 h的血清IL-6、sIL-2R水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但2 h與12、24、48 h時(shí)的血清IL-6、sIL-2R水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。大承氣湯組大鼠2、6 h時(shí)的血清IL-6、sIL-2R水平與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），大承氣湯組48 h IL-6水平明顯低于模型組，12、24 h IL-6水平均明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），大承氣湯組 24、48 h sIL-2R 水平均明顯低于模型組，12 h sIL-2R水平明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。

2.2 各組胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率比較 經(jīng)檢測(cè)，空白組及模型組大鼠的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率較低，大承氣湯組大鼠 2、6、12、24、48 h 的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率均顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；大承氣湯組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)IL-6、sIL-2R水平比較（±s，pg/mL）

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)IL-6、sIL-2R水平比較（±s，pg/mL）

注：與同組 2 h 比較，aP＜0.05；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，bP＜0.05；與模型組及大承氣湯組比較，cP＜0.05

sIL-2R 20.02±8.39 24.27±10.22 100.28±12.36a 120.25±18.17a 110.23±13.29a 21.38±7.36 23.45±9.98 150.47±21.36ab 75.27±12.21ab 40.33±10.03ab 23.25±20.43c組別模型組時(shí)間（h）2 6 1 2 24 48大承氣湯組2 6 1 2空白組24 48 3 n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 IL-6 60.37±10.12 63.23±18.74 150.48±20.33a 200.25±30.23a 210.00±28.73a 55.32±9.97 59.57±20.21 100.38±18.73ab 160.32±16.32ab 110.11±19.57ab 50.45±20.32c

表2 各組胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率比較（±s）

表2 各組胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率比較（±s）

注：與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05

組別模型組24 48時(shí)間（h）2 6 1 2大承氣湯組2 6 1 2空白組細(xì)胞凋亡率（%）1.21±0.29 2.34±0.87 2.97±0.46 3.09±0.46 2.21±0.58 16.29±0.48a 19.39±0.35a 17.39±0.52a 18.34±0.41a 24.32±0.31a 0.81±0.09 24 48 3 n 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6

3 討 論

有研究證實(shí)，SAP的發(fā)生與腸道細(xì)菌移位有著密切的關(guān)系，SAP患者的腸黏膜屏障受到破壞，大量體液會(huì)丟失，從而導(dǎo)致腸道缺血、缺氧[5-6]。同時(shí)胃腸道功能減弱，腸道細(xì)菌移位導(dǎo)致內(nèi)毒素產(chǎn)生，進(jìn)而體內(nèi)炎癥介質(zhì)被激活；胰腺細(xì)胞的壞死、溶解，細(xì)胞壞死增加而細(xì)胞凋亡減少[7]。IL-6是重要的促炎性細(xì)胞因子之一，能直接激活炎癥細(xì)胞，催化和放大炎性反應(yīng)，并能損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，與SAP病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[8]；sIL-2R是一種重要的免疫抑制劑，可中和、活化T細(xì)胞周圍的IL-2，減弱機(jī)體的內(nèi)分泌效應(yīng)，抑制已活化的T細(xì)胞的克隆化擴(kuò)增。同樣與SAP病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠血清IL-6、sIL-2R水平的變化和胰腺細(xì)胞凋亡之間存在著線性關(guān)系。造模成功后，模型組及大承氣湯組大鼠的血清IL-6、sIL-2R水平在2、6、12、24、48 h 各時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的升高，具體為模型組IL-6水平在造模后6 h開始上升，在48 h達(dá)到峰值；sIL-2R在造模后6 h開始上升，在24 h達(dá)到峰值。大承氣湯組IL-6水平在造模后6 h開始升高，24 h達(dá)到峰值，隨后下降，sIL-2R水平在造模后6 h開始升高，12 h達(dá)到峰值，隨后下降，但模型組峰值明顯高于大承氣湯組。大承氣湯組的峰值提前出現(xiàn)，并且峰值水平下降，這表明大承氣湯發(fā)揮了減少T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞炎癥介質(zhì)的釋放，阻斷了炎癥介質(zhì)引起的“瀑布”式反應(yīng)，起到了治療效果。有研究表明，IL-6能夠降低肝臟對(duì)于細(xì)胞內(nèi)毒素的清理，使炎癥致病因子進(jìn)入血液循環(huán)，從而加快其他臟器的損害，加重SAP的病情[9]。在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率水平來(lái)看，模型組各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率均低于大承氣湯組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明大承氣湯可以通過(guò)拮抗炎性因子的釋放，減輕周圍組織炎性反應(yīng)，并提高胰腺腺泡細(xì)胞凋亡率，凋亡的細(xì)胞可以將細(xì)胞內(nèi)的酶原釋放到細(xì)胞外，從而減輕組織周圍的炎性反應(yīng)[10]，達(dá)到減輕SAP癥狀的目的。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)雖然沒有明確的急性胰腺炎病名，但從急性胰腺炎的癥狀和體征上來(lái)講，當(dāng)歸屬于“胃脘痛”范疇。唐喜玉等[11]指出，急性胰腺炎是由于各種病因?qū)е乱认俳M織所分泌的消化酶在胰腺內(nèi)被激活，從而對(duì)胰腺自身組織進(jìn)行消化的胰腺急性化學(xué)性炎癥，屬中醫(yī)學(xué)“里證”“實(shí)證”“熱證”，治宜通腑泄熱、活血化瘀、行氣止痛。其代表方劑——大承氣湯是《傷寒論》的經(jīng)典方劑，針對(duì)SAP腹?jié)M脹痛，大便不通，集合中醫(yī)“通則不痛”的理論，具有通里攻下、清熱解毒、瀉下逐滿的功效。大承氣湯組方（大黃、厚樸、枳實(shí)、芒硝）簡(jiǎn)單，但其實(shí)際臨床使用方便，效果較好，絕大部分患者在西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上運(yùn)用大承氣湯后，起到了增效的作用。為探求其有效成分，有研究發(fā)現(xiàn)，大承氣湯中大黃等可以消食導(dǎo)滯，通里攻下，清除腸道內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素，具有保護(hù)和恢復(fù)腸道黏膜的屏障作用，減少SAP休克的發(fā)生率并能夠縮短病程[12]。早期運(yùn)用大承氣湯可以改善腸道功能，抑制細(xì)菌移位，加快SAP的恢復(fù)[13]。大黃能有效促進(jìn)胃腸功能恢復(fù)，增加腸蠕動(dòng)及腸張力，避免胰腺和全身的繼發(fā)感染，有效改善SAP患者因腸功能衰竭導(dǎo)致的細(xì)菌移位，同時(shí)抑制胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶，防止胰酶引起胰腺組織自身消化[14]。枳實(shí)、厚樸行氣活血止痛，具有抗菌、抗病毒、清除內(nèi)毒素及炎性因子作用，刺激消化道黏膜，引起反射性興奮，增加小腸蠕動(dòng)，調(diào)整胃腸功能，促進(jìn)胃排空以減輕腹脹；芒硝清熱瀉下，可清除腸道燥熱實(shí)積，減少胃腸道壓力，與大黃協(xié)同達(dá)到通腑泄?jié)岬墓π15]，提高機(jī)體的免疫力。但大承氣湯治療SAP的確切機(jī)制還有待廣大學(xué)者進(jìn)一步研究及闡明，本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)IL-6、sIL-2R及細(xì)胞凋亡率進(jìn)行了探索，在臨床上起到了佐證大承氣湯治療SAP有效的結(jié)果。作者認(rèn)為，在臨床上加用大承氣湯治療SAP較單純西醫(yī)治療所取得的效果更加顯著。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)胰腺疾病學(xué)組.中國(guó)急性胰腺炎診治指南（草案）[J].胰腺病學(xué)，2005，24（3）：190-192.

[2]董濤，欒春艷，金偉，等.簡(jiǎn)易腹腔灌洗聯(lián)合早期血液濾過(guò)治療重癥急性胰腺炎[J].中華胰腺病雜志，2011，11（1）：8-10.

[3]劉君君，陳墾，龍友明，等.L-精氨酸誘導(dǎo)大鼠急性壞死性胰腺炎模型的建立[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（10）：1392-1394.

[4]呂冠華，王長(zhǎng)洪，王立新，等.大承氣湯對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠細(xì)胞因子及外周血γδT細(xì)胞的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2008，16（6）：355-358.

[5]梁興梅，田旭，傅思武.腸道細(xì)菌移位的研究進(jìn)展[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2012，24（5）：470-471.

[6]趙宏賢，楊曉紅，李昌平，等.重癥急性胰腺炎對(duì)大鼠小腸平滑肌細(xì)胞凋亡的影響[J].世界華人消化雜志，2014，22（28）：4231-4236.

[7]林旭紅，李永渝.急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制及相關(guān)治療的研究進(jìn)展[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26（5）：1029-1032.

[8]YAGCI G，GUL H，SIMSEK A，et al.Beneficial effects of N-acetylcysteine on Sodium taurocholate-induced pancreatitis in rats[J].J Gastroenterol，2004，39（3）：268-276.

[9]王晶，孟憲梅，任麗梅.IL-6在急性胰腺炎中與肝功能損害的關(guān)系[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（34）：150-151.

[10]SALUJA A，HOFBAUER B，YAMAGUCHI Y，et al.Induction of apoptosis reduces the severity of caerulein-induced pancreatitis in mice[J].Biochem Biophys Res Commun，1996，220（3）：875-878.

[11]唐喜玉，查景園，許奎，等.急性胰腺炎早期中藥干預(yù)治療的時(shí)機(jī)選擇探討[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2013，25（7）：588-590.

[12]欽丹萍，魏霞，方國(guó)棟，等.全程應(yīng)用大承氣湯加味方對(duì)重癥急性胰腺炎模型大鼠腸黏膜屏障的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，35（12）：1482-1489.

[13]魏霞，欽丹萍，賴登攀，等.大承氣湯加味方對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠腸功能衰竭的干預(yù)作用[J].中醫(yī)雜志，2013，54（16）：1407-1411.

[14]潘杰鋒，張劍杰，方劍俊.中藥三聯(lián)療法治療重癥急性胰腺炎32例[J].中國(guó)藥業(yè)，2010，19（22）：86-87.

[15]孫運(yùn)萍.大承氣湯對(duì)重癥急性胰腺炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、PAF 的影響[J].實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2009，9（1）：1-4.