王雪礁， 王 森， 李姍姍,， 李志偉， 徐巧燕， 鄭 棟， 董俊偉， 萬一平， 高孟春??

(1. 中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100； 2. 青島大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266071；3. 中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266100)

TiO2納米顆粒(TiO2Nanoparticles，簡稱TiO2NPs)因其具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)以及優(yōu)良的力學(xué)、電學(xué)和化學(xué)性能，被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)、電子工業(yè)、生物醫(yī)療等領(lǐng)域[1-2]。TiO2NPs的廣泛應(yīng)用不可避免地會在生產(chǎn)、運(yùn)輸和使用過程中釋放到環(huán)境中去，從而大大地增加了人、動物和植物與TiO2NPs的接觸機(jī)會，其潛在的環(huán)境效應(yīng)和生態(tài)風(fēng)險已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。大量關(guān)于TiO2NPs毒理學(xué)的研究結(jié)果表明[3-9]，TiO2NPs具有納米尺度，能穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入生命體的任何部位，引發(fā)細(xì)胞炎癥和生物肺部腫瘤，對人體器官、微生物和動物等產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)。進(jìn)入環(huán)境中的TiO2NPs可通過在土壤、水和空氣等環(huán)境介質(zhì)中遷移而進(jìn)入水環(huán)境，最終出現(xiàn)在廢水生物處理系統(tǒng)。

鑒于TiO2NPs具有較強(qiáng)的生物毒性，可能通過抑制微生物活性而改變廢水生物處理系統(tǒng)中活性污泥(或生物膜)的生化特性，引起微生物群落結(jié)構(gòu)變化，從而影響活性污泥(或生物膜)對廢水中有機(jī)物、氮和磷等污染物的去除效果。Zheng等[10]發(fā)現(xiàn)，在長期暴露條件下50 mg/L TiO2NPs抑制了序批式生物反應(yīng)器(Sequencing Batch Reactor，簡稱SBR)的生物脫氮性能并導(dǎo)致SBR中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。Yang等[11]報道，在長期暴露條件下，0.5～2.0 mg/L TiO2NPs 能明顯地影響厭氧-好氧-SBR中活性污泥絮體的物理化學(xué)穩(wěn)定性。Li等[12]發(fā)現(xiàn)，短期暴露條件下 2～50 mg/L TiO2NPs 對SBR的脫氮性能沒有影響, 然而當(dāng)TiO2NPs濃度從100 mg/L增加到200 mg/L時，總氮去除效率從36.5%降低到 20.3%。眾所周知，在活性污泥法處理廢水過程中，微生物分泌胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances, 簡稱EPS)能夠影響生物反應(yīng)器內(nèi)微生物聚集體的特性、活性污泥的絮凝、沉降和脫水性[13-15]。EPS主要由蛋白質(zhì)(Protein，簡稱PN)、糖類(Polysaccharide，簡稱PS)、核酸、脂類、腐殖酸以及一些無機(jī)組分組成，其中，PN和PS是EPS的主要組成部分，約占EPS總量的70%～80%[16]。已有文獻(xiàn)報道，廢水中有毒物質(zhì)的存在能夠影響微生物分泌的EPS產(chǎn)量和組分[17-19]，從而抵御有毒物質(zhì)對微生物的毒害作用。TiO2NPs作為一種潛在生物毒性的物質(zhì)在活性污泥法處理廢水過程中可能影響微生物分泌的EPS產(chǎn)量和組分，從而可能改變活性污泥的絮凝、沉降和脫水性，進(jìn)一步影響活性污泥的性能。因此，評價TiO2NPs濃度變化對活性污泥胞外聚合物產(chǎn)量及其組分的影響是非常有意義的工作。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)TiO2NPs對SBR的活性污泥中胞外聚合物特性影響的相關(guān)研究。本文研究了長期暴露條件下TiO2NPs濃度變化對SBR的活性污泥中緊密附著EPS(TB-EPS)和松散附著EPS(TB-EPS)中PN和PS含量的影響，通過三維熒光光譜(3D-EEM)和傅里葉紅外光譜(FTIR)分析LB-EPS和TB-EPS化學(xué)組成的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及運(yùn)行條件

本試驗(yàn)采用SBR反應(yīng)器是由有機(jī)玻璃管制成，有效高度和內(nèi)徑分別為50和14 cm，有效容積7.7 L，容積交換率為50%。進(jìn)水通過蠕動泵進(jìn)入SBR，通過電磁閥控制排水。空氣壓縮機(jī)通過砂芯曝氣頭從反應(yīng)器底部通入空氣，缺氧階段通過磁力攪拌器使進(jìn)水與活性污泥混合。在好氧階段結(jié)束前，排出一定量的污泥，保證系統(tǒng)的除磷效果，使污泥齡保持在20 d左右。反應(yīng)器運(yùn)行參數(shù)如下：缺氧階段2.5 h，好氧階段4 h，攪拌階段1 h，沉淀階段0.3 h，排水階段0.2 h。進(jìn)水、曝氣、攪拌、沉淀和排水通過時間繼電器實(shí)現(xiàn)自動控制。SBR每個周期為8 h，1 d運(yùn)行3個周期。在SBR運(yùn)行過程中，缺氧階段的DO低于0.5 mg/L，好氧階段的DO高于2 mg/L。本研究是在夏季有空調(diào)和冬季有暖氣的情況下進(jìn)行，室內(nèi)溫度25℃左右。

1.2 接種污泥和進(jìn)水水質(zhì)

1.3 TiO2 NPs儲備液配制

本論文所用TiO2NPs購于北京德科島金科技有限公司，粒徑35 nm，純度99.9%，白色疏松粉末。根據(jù)Keller 等[20]報道的納米顆粒配制儲備液的方法如下：稱取0.5 g TiO2NPs，干燥滅菌后在超凈臺中冷卻，然后加入1 L經(jīng)0.22 μm濾膜滅菌的Milli-Q水(pH=7.0)，用磁力攪拌器混合攪拌30 min后，再在25 ℃，250 W，40 kHz條件下超聲1 h，隨后在25 ℃，150 r/min的條件下放置1夜。儲備液在稀釋到模擬廢水前，為了打碎TiO2NPs聚集體，應(yīng)在25 ℃，250 W，40 kHz條件下再超聲1 h。

1.4 分析方法

1.5 胞外聚合物提取和分析方法

1.5.1 胞外聚合物提取和測定 依據(jù)Li和Yang[22]的方法適當(dāng)修改后提取LB-EPS和TB-EPS，具體步驟如下：在SBR攪拌階段每次取活性污泥樣品40 mL，將其在6 000 r/min下離心5 min，棄去上清液，得到濃縮的活性污泥樣品；用預(yù)熱到70 ℃的NaCl溶液(鹽度為3%)稀釋至40 mL，蓋緊蓋子并快速振蕩1 min；將提取后的混合液于6 000 r/min離心10 min；收集上清液，即為LB-EPS。用鹽度為3%NaCl溶液稀釋至40 mL，60 ℃水浴30 min后6 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為TB-EPS。每次做三次平行樣。上清液經(jīng)過0.45 μm醋酸纖維素膜過濾后分析LB-EPS和TB-EPS中PN和PS含量。PN含量采用Folin酚法測定[17]，PS含量采用蒽酮比色法測定[18]。

1.5.2 三維熒光光譜分析 LB-EPS和TB-EPS三維熒光光譜(3D-EEM)采用熒光分光光度計(jì)(F-4600，Hitachi，日本)測定。激發(fā)波長(Ex)范圍200～400 nm，掃描間隔5 nm；發(fā)射波長(Em)范圍200～500 nm，掃描間隔5 nm；激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫均為10 nm，掃描速度為1 200 nm/min。采用Origin 8.1軟件繪制光譜圖。

1.5.3 傅里葉變換紅外光譜分析 LB-EPS和TB-EPS紅外光譜(FTIR)采用傅里葉變換紅外光譜儀(Tensor 27，Bruker Optics，德國)測定。LB-EPS和TB-EPS提取液經(jīng)過冷凍干燥處理后與光譜純KBr按照1:100研磨混合，并于一定壓力下保持若干分鐘制成半透明薄片，在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描，檢測器分辨率為4 cm-1。

2. 結(jié)果與討論

2.1 TiO2 NPs濃度變化對SBR性能的影響

表1為在長期暴露條件下TiO2NPs濃度變化對SBR性能影響情況。

表1 長期暴露條件下TiO2 NPs濃度變化對SBR性能的影響

Note：①Influent TiO2NPs concentration；②Operational time；③Influent concentration；④Effluent concentration；⑤Removal efficiency

2.2 TiO2 NPs濃度變化對活性污泥中LB-EPS和TB-EPS的PN和PS含量影響

在進(jìn)水TiO2NPs濃度分別為0、5、10、30和60 mg/L時，考察了活性污泥中LB-EPS和TB-EPS產(chǎn)量及其主要組分的變化。由圖1可知，LB-EPS和TB-EPS產(chǎn)量隨著進(jìn)水TiO2NPs濃度的增加而逐漸地增加。進(jìn)水TiO2NPs濃度的增大導(dǎo)致其對SBR中微生物的毒性增強(qiáng)，活性污泥中微生物就通過分泌更多的EPS聚集在細(xì)胞表面或細(xì)胞外抵御TiO2的毒性。圖2表示TiO2NPs濃度變化對活性污泥中LB-EPS和TB-EPS中PN和PS含量的影響。當(dāng)進(jìn)水TiO2NPs濃度從0 mg/L逐漸地增加到60 mg/L時，LB-EPS和TB-EPS中PN含量分別從4.03 和18.53 mg/(g MLVSS)增加到了33.73和87.16 mg/(g MLVSS)。與進(jìn)水TiO2NPs濃度為0 mg/L相比，PN含量在進(jìn)水TiO2NPs濃度為60 mg/L時分別增加了7.37和3.70倍，表明TiO2NPs的出現(xiàn)使LB-EPS中PN增加速率明顯地高于TB-EPS中PN增加量。活性污泥中LB-EPS的PS含量從0 mg/L TiO2NPs時的1.06 mg/(g MLVSS)逐漸增加到10 mg/L TiO2NPs時的6.68 mg/(g MLVSS)，在10和60 mg/L TiO2NPs時又分別降低為4.28和1.80 mg/(g MLVSS)。楊曉南[23]報道了TiO2NPs在廢水生物處理系統(tǒng)的長期暴露使微生物表面由于吸附、卷掃及靜電力等作用使其在表面吸附了TiO2NPs，使微生物細(xì)胞膜表面被大量的TiO2NPs所覆蓋，阻礙了營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，導(dǎo)致活性污泥微生物細(xì)菌活性降低，胞外聚合物中多糖含量減少。

圖1 不同TiO2 NPs濃度對活性污泥中LB-EPS和TB-EPS含量的影響Fig.1 Effect of different TiO2 NPs concentrations on the LB-EPS and TB-EPS contents of activated sludge

然而，活性污泥中TB-EPS的PS含量隨著進(jìn)水中TiO2NPs濃度增加而逐漸增加，這說明TiO2NPs的出現(xiàn)對LB-EPS和TB-EPS中PS含量的影響是不同的。在整個實(shí)驗(yàn)過程中LB-EPS和TB-EPS中的PN含量始終高于PS 含量。EPS中的蛋白質(zhì)PN能夠通過擴(kuò)散限制或/以及化學(xué)反應(yīng)，減緩或阻止有害物質(zhì)進(jìn)入微生物，是保護(hù)細(xì)胞免受損傷的主要成分，這說明EPS中高PN含量有利于使活性污泥中微生物的細(xì)胞免受TiO2NPs的損傷。

2.3 TiO2 NPs濃度變化對活性污泥中LB-EPS和TB-EPS主要化學(xué)組分的影響

為了評價TiO2NPs濃度變化對SBR中活性污泥的LB-EPS和TB-EPS化學(xué)組成的影響，考察了進(jìn)水濃度TiO2NPs為0、5、10和60 mg/L時LB-EPS和TB-EPS的3D-EEM光譜圖(見圖3)。在EPS的3D-EEM光譜中X軸和Y軸分別代表著發(fā)射光譜，等高線代表熒光強(qiáng)度。每一個熒光峰代表著某一類化學(xué)物質(zhì)，其位置以Em/Ex來表示。由圖3可知，在所取的4個污泥樣品中LB-EPS和TB-EPS共發(fā)現(xiàn)了5個特征熒光峰，其位置如下：

圖2 不同TiO2 NPs濃度對LB-EPS和TB-EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量的影響Fig. 2 Effect of different TiO2 NPs concentrations on the PN and PS contents of LB-EPS and TB-EPS

關(guān)于熒光峰A(220-225/340-345 nm)、熒光峰B(275-280/335-345 nm)、熒光峰C(220-225/310-320 nm)、熒光峰D(355-375/445-460 nm)和熒光峰E(270-275/445-460 nm)，根據(jù)以往文獻(xiàn)報道[24-26]，熒光峰A、熒光峰B和熒光峰C分別與芳環(huán)蛋白類物質(zhì)、色氨酸蛋白類物質(zhì)以及簡單芳環(huán)蛋白類物質(zhì)有關(guān)；熒光峰D和熒光峰E分別與胡敏酸類物質(zhì)和富里酸類物質(zhì)有關(guān)。在進(jìn)水TiO2NPs為0 mg/L時，LB-EPS的3D-EEM熒光光譜中出現(xiàn)了熒光峰A和熒光峰B，TB-EPS的3D-EEM熒光光譜中出現(xiàn)了熒光峰A、熒光峰B和熒光峰C。與0 mg/L TiO2NPs時相比，在TiO2NPs濃度為5、10和60 mg/L時LB-EPS的3D-EEM熒光光譜中分別增加了熒光峰D、熒光峰E和熒光峰E。TB-EPS的3D-EEM熒光光譜在TiO2NPs濃度為5和60 mg/L時分別增加了熒光峰D、熒光峰D和熒光峰E，但是未發(fā)現(xiàn)熒光峰C。熒光峰D和熒光峰E隨著進(jìn)水TiO2NPs濃度增加而逐漸在LB-EPS和TB-EPS中出現(xiàn)，說明在TiO2NPs刺激下EPS中產(chǎn)生了胡敏酸類物質(zhì)和富里酸類物質(zhì)。

((a1)LB-EPS(0 mg/L)；(b1)TB-EPS(0 mg/L)；(a2)LB-EPS(5 mg/L)；(b2)TB-EPS(5 mg/L)；

表2表示進(jìn)水中TiO2NPs濃度變化對活性污泥中LB-EPS和TB-EPS的3D-EEM光譜中熒光峰位置(Ex/Em)和熒光強(qiáng)度的影響。熒光峰位置沿著EX軸(或Em)方向刻度增加稱為紅移現(xiàn)象，反之稱為藍(lán)移現(xiàn)象。與進(jìn)水中TiO2NPs濃度為0 mg/L時熒光峰A位置相比，LB-EPS中熒光峰A在TiO2NPs濃度為5 mg/L時沿著Ex/Em軸紅移了5 nm/15 nm，在TiO2NPs濃度為10和60 mg/L時分別沿著Em軸紅移了15和10 nm；TB-EPS中熒光峰A在TiO2NPs濃度為5 mg/L時未發(fā)生紅移或藍(lán)移，在TiO2NPs濃度為10 mg/L時沿著Em軸紅移了5 nm，而在TiO2NPs濃度為60 mg/L時沿著Ex/Em軸紅移了5 nm/5 nm。與進(jìn)水中TiO2NPs濃度為0 mg/L時熒光峰B位置相比，TB-EPS中熒光峰B在TiO2NPs濃度為5 mg/L時沿著Ex/Em軸紅移了5 nm/40 nm，在TiO2NPs濃度為10和60 mg/L時分別沿著Em軸紅移了35和30 nm；TB-EPS中熒光峰B在TiO2NPs濃度為5、10和60 mg/L時分別沿著Em軸紅移了5、5和5 nm。在TiO2NPs濃度為60 mg/L時TB-EPS中熒光峰C相對于TiO2NPs濃度為5 mg/L時TB-EPS中熒光峰D沿著Em軸藍(lán)移了5 nm，而與進(jìn)水中TiO2NPs濃度 10 mg/L時LB-EPS中熒光峰E相比TiO2NPs濃度 60 mg/L時LB-EPS中熒光峰E位置沿著Ex軸紅移了5 nm。根據(jù)以往文獻(xiàn)報道[25]，熒光峰的紅移與熒光基團(tuán)中羰基、羧基、羥基和氨基的增加密切相關(guān)的。本研究中熒光峰的紅移可能是由于進(jìn)水中TiO2NPs出現(xiàn)使高激發(fā)波長類色氨酸中的羰基、羧基等官能團(tuán)的含量增多，導(dǎo)致熒光峰的紅移。熒光峰的藍(lán)移與其所含苯環(huán)數(shù)量的降低相關(guān)的，這可能是進(jìn)水中TiO2NPs出現(xiàn)導(dǎo)致熒光峰A所代表的芳環(huán)蛋白類物質(zhì)中苯環(huán)數(shù)量降低。不同熒光峰的紅移由表2可知，熒光峰A、熒光峰B、熒光峰C、熒光峰D和熒光峰E的熒光強(qiáng)度在不同的進(jìn)水TiO2NPs濃度或增大或減少，這進(jìn)一步說明了進(jìn)水中TiO2NPs的出現(xiàn)能夠影響LB-EPS和TB-EPS的化學(xué)組成。

表2 活性污泥的LB-EPS和TB-EPS中熒光峰特征

2.4 TiO2 NPs濃度變化對活性污泥中LB-EPS和TB-EPS官能團(tuán)的影響

為了評價TiO2NPs對活性污泥中LB-EPS和TB-EPS的官能團(tuán)影響，本研究考察了進(jìn)水濃度TiO2NPs為0、5、10和30 mg/L時LB-EPS和TB-EPS的FTIR光譜圖變化情況(見圖4)。3 400 cm-1附近的寬吸收峰與多糖化合物中的羥基和蛋白質(zhì)類物質(zhì)中的氨基的伸縮振動相關(guān)[27]，3 006 cm-1附近的吸收峰是C-H拉伸造成的[28]，1 639 cm-1附近的吸收峰是由蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中β-折疊的C=O伸縮振動導(dǎo)致[29]，1 400 cm-1附近吸收峰是甲基中C-H鍵振動產(chǎn)生的[30]，1 116 cm-1附近吸收峰是多糖類化合物和芳香族化合物中C-O鍵的伸縮振動導(dǎo)致[31]，615 cm-1附近屬于指紋區(qū)，表明樣品中存在著不飽和鍵。由圖4可知，在活性污泥中LB-EPS和TB-EPS的FTIR光譜中3 400、1 640、1 400和1 110 cm-1附近有明顯的吸收峰存在，表明了LB-EPS和TB-EPS中存在著蛋白質(zhì)類化合物和多糖類化合物。在不同進(jìn)水TiO2NPs濃度變化時，LB-EPS和TB-EPS的FTIR光譜是類似的，但是每個峰的相對強(qiáng)度卻發(fā)生了相應(yīng)的變化。與0 mg/L TiO2NPs相比，LB-EPS中3 400 cm-1附近峰相對強(qiáng)度在5 mg/L TiO2NPs時明顯地增加，隨后隨著進(jìn)水TiO2NPs濃度增加而有所降低，然而TB-EPS中3 400 cm-1附近峰相對強(qiáng)度隨著TiO2NPs濃度增加未呈現(xiàn)明顯的變化。LB-EPS和TB-EPS中1 640和1 110 cm-1附近吸收峰在5 mg/L TiO2NPs時明顯地增加，隨后隨著進(jìn)水TiO2NPs濃度增加而有所降低。LB-EPS和TB-EPS中1 640和1 110 cm-1附近吸收峰在5 mg/L TiO2NPs時明顯地增加，隨后隨著進(jìn)水TiO2NPs濃度增加而有所降低。1 640 cm-1附近吸收峰所代表的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中β-折疊可以促進(jìn)污泥絮體的絮凝，進(jìn)水TiO2NPs濃度增加可能影響SBR中活性污泥的絮凝過程。1 400 cm-1附近吸收峰的相對強(qiáng)度在TiO2NPs濃度為0、5和10 mg/L時沒有明顯變化，但在TiO2NPs濃度為30 mg/L時有輕微增加。目前研究結(jié)果表明，進(jìn)水TiO2NPs 濃度變化對活性污泥的LB-EPS和TB-EPS中多糖和蛋白質(zhì)的官能團(tuán)有著明顯的影響。

圖4 不同TiO2 NPs濃度下LB-EPS和TB-EPS的紅外光譜Fig. 4 FTIR spectra of LB-EPS and TB-EPS at different TiO2 NPs concentration

3 結(jié)論

(1)當(dāng)TiO2NPs濃度為10～60 mg/L時對SBR反應(yīng)器中COD去除只產(chǎn)生了輕微抑制，但是并未影響活性污泥的硝化過程。磷的去除率在TiO2NPs濃度從0 mg/L逐漸增加到5 mg/L過程中是逐漸降低，隨后在TiO2NPs濃度從10 mg/L逐漸增加到60 mg/L過程中出現(xiàn)了逐漸升高的趨勢。

(2)活性污泥中LB-EPS和TB-EPS產(chǎn)量隨著進(jìn)水TiO2NPs濃度從0 mg/L增加到60 mg/L而逐漸增加。

(3)進(jìn)水中TiO2NPs濃度變化使LB-EPS和TB-EPS的3D-EEM熒光光譜中代表不同化學(xué)組成的熒光峰消失或增加，或者熒光峰位置發(fā)生了紅移或藍(lán)移，表明TiO2NPs濃度變化影響了LB-EPS和TB-EPS的化學(xué)組成。

(4)LB-EPS和TB-EPS的FTIR光譜中不同吸收峰的強(qiáng)度隨著TiO2NPs濃度變化變化而變化，說明TiO2NPs濃度變化對LB-EPS和TB-EPS中PN和PS 的官能團(tuán)有明顯的影響。

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