張 梅， 米鐵柱??， 甄 毓， 王華龍

(1. 中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266100； 2. 海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100；3. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，山東 青島 266071；4.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003 )

化石燃料的大量燃燒是導致全球變暖的主要原因，生物燃料是可替代化石燃料的可再生能源，脂肪族生物燃料由于其熱值高、性能好而受到廣泛重視。其中，微藻脂肪酸的高生產(chǎn)量使其成為生物燃料研究的熱點之一[1]。近年來隨著微藻脂肪酸生物功能研究的不斷深入，科學界發(fā)現(xiàn)微藻生產(chǎn)油脂具有其他生物無法替代的優(yōu)點：微藻是光合效率最高的原始植物之一，周期短，生產(chǎn)量大；很多微藻可以在海水中生長，節(jié)省了淡水資源和土地資源；微藻的油脂含量較高，一般可以達到藻體干重的20%，最高甚至可達60%[2-3]。盡管產(chǎn)油微藻具有代替化石燃料的潛力[4]，其商業(yè)化應用仍存在巨大的經(jīng)濟挑戰(zhàn)，需要從分子生物學和基因工程等方面加強對微藻脂肪酸生物合成的研究，以達到降低生產(chǎn)成本的目的。因此，研究微藻的脂肪酸合成途徑不僅對其生理過程有重要意義，而且還有較為廣泛的應用前景。

從生態(tài)學角度來看，微藻是海洋初級生產(chǎn)力的主要貢獻者，其生產(chǎn)力的高低直接影響著整個海洋生態(tài)系統(tǒng)[5]。從分子水平解釋微藻的生理功能、合成和代謝途徑，對研究微藻的生長、發(fā)育和繁殖具有重要的意義。在實際應用方面，轉錄組學研究有助于解釋赤潮發(fā)生、發(fā)展以及消亡的內在分子機制，能夠為赤潮的預防和治理提供有效的理論依據(jù)。

骨條藻(Skeletonemaspp.)是一類廣溫廣鹽型海洋微型浮游硅藻，有時會引發(fā)赤潮[6]。由于骨條藻種類之間的形態(tài)學差異非常細微，鑒定難度大，長期以來一直以中肋骨條藻(S.costatum)作為該屬的模式種和代表進行研究，在涉及到骨條藻的生理生化研究中，并未對研究對象進行嚴格的區(qū)分鑒定，一般都被當作是中肋骨條藻?，斒瞎菞l藻(S.marinoi)是骨條藻屬5種今生種之一，于2005年由Sarno等人分離確認[7]。S.marinoi分布廣泛，在我國的長江口及香港海域均有發(fā)現(xiàn)，其從3月份開始進入快速繁殖期，是長江口赤潮高發(fā)區(qū)的優(yōu)勢種。本文以S.marinoi為研究對象，確定了其脂肪酸生物合成途徑中的相關基因，并在此基礎上分析了S.marinoi的脂肪酸生物合成途徑及其在不同生長時期的基因表達差異，以期為闡明微藻脂肪酸生物合成的內在機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 S. marinoi藻種的培養(yǎng)

瑪氏骨條藻(Skeletonemamarinoi)自青島近海海域分離得到，保存于中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室藻種室，培養(yǎng)基為常規(guī)f/2培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為(20±1)℃，培養(yǎng)過程光暗比控制為12 h/12 h，光照強度為80～100 μmol·m-2·s-1。實驗所用海水取自青島近海，鹽度為33，pH為7.8～8.0。

1.2 測序樣品準備

將分離得到的S.marinoi在實驗室進行培養(yǎng)，基于S.marinoi的生長趨勢，收集指數(shù)期(Exponential Phase, EP)、穩(wěn)定期(Stationary Phase, SP)以及衰亡期(Decline Phase, DP)的藻細胞。對不同生長時期的S.marinoi分別進行離心收集，將離心收集到的藻細胞快速放入液氮中速凍保存。每個樣品設置3個平行樣進行生物學重復，樣品由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行總RNA的提取及Illumina Hiseq2000雙端測序。

1.3數(shù)據(jù)預處理及從頭拼接

將獲得的核苷酸原始序列(Raw Reads)進行可信度分析和質量評估，去除核苷酸序列中帶接頭的、低質量序列得到有效序列(Clean Reads)。用拼接軟件Trinity[8](版本：r2012-10-05)將有效序列進行從頭拼接，得到的轉錄本序列信息的儲存方式為FASTA格式，以此形成一個轉錄組，作為分析的參考序列。

1.4 功能注釋及代謝途徑分析

功能注釋和代謝途徑分析使用的數(shù)據(jù)庫有7個，分別為Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG以及GO數(shù)據(jù)庫。利用NCBI blast 2.2.28+[9]對拼接形成的轉錄本與Nr、Nt、Swiss-Prot以及KOG數(shù)據(jù)庫進行比對，其中，Nr、Nt和Swiss-Pro數(shù)據(jù)庫比對evalue閾值為1e-5，對于每條unigene展示top10比對結果(如果符合條件)，KOG比對evalue閾值為1e-3。通過HMMER 3.0程序，搜索已建好的蛋白結構域的HMM模型，對Pfam蛋白結構域進行預測。GO功能注釋利用Blast2GO v2.5[10]和自寫腳本來完成。利用KAAS服務器進行KEGG代謝途徑分析，KAAS對轉錄本序列進行逐一注釋，對成功注釋的轉錄本分配到相應的EC編號和其所參與的代謝途徑[11-12]。最后，將Trinity拼接得到的轉錄組作為參考序列(ref)，利用RSEM[13]軟件將每個樣品上的clean reads往ref上做mapping，對bowtie的比對結果進行統(tǒng)計，得到每個樣品比對到每一個基因上的read count數(shù)目。

2 結果與討論

2.1 轉錄組測序信息及拼接

通過Illumina Hiseq2000測序平臺進行雙端測序，總共獲得60 936 371條原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過測序數(shù)據(jù)過濾后得到的有效序列為58 592 306條，占原始序列的96.15%。利用從頭拼接得到的轉錄本數(shù)為39 058個，非重復序列基因(unigene)為20 139個，長度范圍為200 ～ 20 000 bp。

2.2 功能注釋及代謝分析

通過與上述Nr、Nt等7個數(shù)據(jù)庫進行比對，發(fā)現(xiàn)注釋成功的unigene個數(shù)為14 693個，占總unigene數(shù)的71.3%。其中，在Nr數(shù)據(jù)庫中注釋的成功率最高，為65.25%，在Nt數(shù)據(jù)庫中的注釋率最低，僅為8.52%。GO 和Pfam數(shù)據(jù)庫注釋的成功率較高，分別為53.28%和51.44%，而Swiss-Prot、KOG和KO數(shù)據(jù)庫注釋的成功率較低，分別為33.46%、20.07%和16.73%。

對拼接得到的所有轉錄本進行GO注釋，將注釋成功的轉錄本按照GO三個大類(生物學過程、細胞成分、分子功能)的下一層級進行分類，劃分為46個類別，包括核糖體結構組分、大分子生物合成、碳利用等。與KOG數(shù)據(jù)庫進行比對，將注釋成功的轉錄本按照功能分成26個子家族，包括RNA加工與修飾、能量產(chǎn)生與轉化、核染色質結構與變化等。對轉錄本進行KO注釋后，將它們參與的KEGG代謝通路進行分類，得到了31個類群，可以匹配到EC編號的轉錄本為3 816個，并注釋為225條不同的代謝途徑，包括氮代謝途徑、脂肪酸生物合成途徑以及氨基酸代謝途徑等。

2.3 脂肪酸合成途徑分析

基于S.marinoi轉錄組的GO功能注釋和KEGG代謝途徑分析，本文已經(jīng)對S.marinoi的氮代謝途徑[14]、碳固定途徑[15]以及硫代謝途徑(未發(fā)表數(shù)據(jù))進行了分析。為了全面構建S.marinoi的代謝網(wǎng)絡，計劃對脂肪酸、氨基酸以及淀粉的生物合成及降解等多個代謝途徑進行解析。在本研究中，主要對S.marinoi的脂肪酸生物合成途徑進行了解析。

通過分析，發(fā)現(xiàn)了與脂肪酸生物合成途徑相關的26種酶以及33個編碼基因的轉錄本。由于微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)已進行了全基因組測序，基因注釋較為完整，且與S.marinoi同屬硅藻，為了分析3 種硅藻脂肪酸合成相關編碼基因的同源性，利用BLASTx比較之后發(fā)現(xiàn)：S.marinoi與同屬中心綱的假微型海鏈藻的基因序列一致性相對較高，而與羽紋綱的三角褐指藻的序列一致性相對較低(見表1)。

結合KEGG的比對結果構建了S.marinoi的脂肪酸生物合成途徑，脂肪酸生物合成包括三個方面：脂肪酸的從頭合成(見圖1)、脂肪酸碳鏈的延長以及不飽和脂肪酸的生成。脂肪酸的從頭合成起始于線粒體中乙酰-CoA的生成，其中，糖酵解過程是產(chǎn)生乙酰-CoA的主要方式，β-氧化和氨基酸代謝也產(chǎn)生乙酰-CoA。真核藻類的脂肪酸從頭合成是在葉綠體中進行的，由于乙酰-CoA是在線粒體中產(chǎn)生，而線粒體內膜不允許乙酰-CoA穿透，乙酰-CoA從線粒體到葉綠體中的輸送需要以檸檬酸為載體來完成。在線粒體中，乙酰-CoA和草酰乙酸在檸檬酸合酶(citrate synthase, CS)的作用下生成檸檬酸，隨后，檸檬酸跨越線粒體內膜進入到細胞溶液中與檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase, ACL)作用生成乙酰-CoA和草酰乙酸，之后乙酰-CoA進入到葉綠體中進行脂肪酸的從頭合成。

S.marinoi脂肪酸碳鏈的延長分為兩個階段，分別在葉綠體和內質網(wǎng)上進行。第一階段是發(fā)生在葉綠體中的脂肪酸從頭合成(見圖1)，合成過程中以不斷延長的?；?ACP為底物，直至C16或C18脂肪酸的生成。第二階段是內質網(wǎng)中的脂酰-CoA延長酶催化C18脂肪酸延長并產(chǎn)生更長碳鏈的脂肪酸(見圖2)，該合成過程中以酰基-CoA為底物，以丙二酸單酰-CoA作為碳鏈延伸的供體，其延長機制與脂肪酸的從頭合成相似。脂酰-CoA延長酶屬于膜綁定的多酶復合體，由β-酮酰-CoA合酶(beta-ketoacyl-CoA synthase, KCS)、β-酮酰-CoA還原酶(beta-ketoacyl-CoA reductase, KCR)、β-羥酰-CoA脫水酶(beta-hydroxyacyl-CoA dehydratase, HCD)以及烯酰- CoA還原酶(enoyl-CoA reductase, ECR)組成，其相繼催化縮合、還原、脫水、還原反應，每一循環(huán)使碳鏈增加2個碳子長度。

S.marinoi單不飽和脂肪酸的合成主要發(fā)生在葉綠體中，其主要形式為葉綠體中的C16:0-ACP或C18:0-ACP在ADD的作用下生成單不飽和脂肪酸C16:1(9)或C18:1(9)。S.marinoi多不飽和脂肪酸的合成是通過原核途徑和真核途徑來配合完成的，原核途徑發(fā)生在葉綠體中，真核途徑發(fā)生在內質網(wǎng)上。真核途徑與原核途徑的主要區(qū)別是真核途徑可以在脂酰-CoA延長酶的作用下使脂?；奶兼溠由臁Ｖ参镏械娜ワ柡兔覆荒苤苯幼饔糜谟坞x脂肪酸，但可作用于甘油脂質。甘油-3-磷酸與?；?CoA或?；?ACP經(jīng)過兩次酰化反應生成甘油脂質。合成甘油脂質后，脂肪酸仍可進一步加工?；谵D錄組的信息，推測S.marinoi多不飽和脂肪酸形成的途徑主要有兩種：一是在葉綠體中形成的C18:1-ACP被轉移到sn-1或sn-2位形成磷酸酰甘油，其與半乳糖殘基作用生成單或二半乳糖二酰基甘油，進一步在Δ12-去飽和酶(delta-12 fatty acid desaturase, Δ12D)的作用下生成亞油酸，亞油酸在Δ15-去飽和酶(delta-15 fatty acid desaturase, Δ15D)的作用下生成α-亞麻酸；二是發(fā)生在內質網(wǎng)上的多不飽和脂肪酸的生成，在葉綠體中生成的C18:0或C18:1(9)游離脂肪酸自由擴散到葉綠體外膜上，被長鏈?；?CoA合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase, LACS)催化為C18:0-CoA或C18:1-CoA，進一步被催化形成磷酸脂，內質網(wǎng)定位的延長酶和去飽和酶可分別催化磷脂酸的脂酰基進行碳鏈延伸和去飽和，其合成途徑主要為ω3和ω6途徑。除了脂酰-CoA延長酶外，還有Δ4D、Δ5D、Δ6D、Δ9D、Δ12D以及Δ15D參與多不飽和脂肪酸的真核合成途徑。多不飽和脂肪酸具體的合成途徑如圖3所示。

(酶由長方形標出，代謝通路由橢圓標出，圖中X6和X7表示循環(huán)次數(shù)。Enzymes or protein are shown in solid boxes and metabolism pathways are shown in cycles. In the Figure, X6 and X7 is the cycle times.)

圖1 基于S.marinoi轉錄組數(shù)據(jù)的從頭拼接及注釋結果構建的脂肪酸從頭合成途徑
Fig.1 Denovo fatty acid synthesis pathway reconstructed based on the de novo assembly and annotation ofS.marinoitranscriptome

(酶由長方形標出。Enzymes or protein are shown in solid boxes.)

圖2 基于S.marinoi轉錄組數(shù)據(jù)的從頭拼接及注釋結果構建的脂肪酸碳鏈延長途徑
Fig.2 Elongation fatty acid synthesis pathway reconstructed based on the de novo assembly and annotation ofS.marinoitranscriptome

2.4 脂肪酸合成途徑中基因差異表達的分析

差異基因表達的輸入數(shù)據(jù)為基因表達水平分析中得到的read count數(shù)據(jù)，采用DESeq對其進行分析[16-18]，篩選閾值為padj<0.05[19],該分析方法基于的模型是負二項分布，第i個基因在第j個樣本中的read count為Kij，則有

以第i個基因的指數(shù)期和穩(wěn)定期的差異表達計算為例，A為指數(shù)期j個樣本中第i個基因read count的平均值，B為穩(wěn)定期j個樣本中第i個基因read count的平均值。設定f=Log2(B/A),若f的絕對值大于2則視為差異顯著。正值視為上調表達，負值視為下調表達。

通過分析S.marinoi脂肪酸生物合成途徑中相關基因的表達情況發(fā)現(xiàn)：在穩(wěn)定期和衰亡期，該通路中相關酶基因的表達量均無顯著差異，而與指數(shù)期相比有著較顯著的差異。在與脂肪酸合成途徑相關的26種酶對應的33個基因中，存在差異表達的基因有15個。圖4中列出了這些差異表達基因在以指數(shù)期的表達水平為基準的情況下的差異表達倍數(shù)。

CS和ACL是植物脂肪酸合成途徑中的關鍵調控酶。童晉[20]通過基因工程的方法在油菜中過量表達CS基因發(fā)現(xiàn)該酶表達量的上升會造成脂肪酸合成量的增加，反義表達則會造成脂肪酸合成量的降低。ACL催化檸檬酸與輔酶A產(chǎn)生乙酰-CoA和草酰乙酸，這是細胞質中產(chǎn)生乙酰-CoA的唯一途徑，除此之外再無其他途徑可補充植物生長發(fā)育所需的乙酰-CoA[21]。在擬南芥中，反義表達ACL基因發(fā)現(xiàn)造成植物矮化、果莢縮短、葉片變小等現(xiàn)象，同時也造成了植物體內脂肪酸合成量的降低[20]。如圖4a,b所示，在S.marinoi脂肪酸合成途徑中，CS的編碼基因在穩(wěn)定期出現(xiàn)了顯著的下調，而ACL的編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)了顯著的下調，這表明在S.marinoi生長的指數(shù)期，由這兩種酶參與的代謝活動可能更為旺盛。CS和ACL作為脂肪酸合成代謝調控途徑中的關鍵酶，影響著細胞內乙酰-CoA的含量，而乙酰-CoA是脂肪酸合成的主要原料，其含量的變化會直接影響脂肪酸的合成。

(酶由長方形標出。Enzymes or protein are shown in solid boxes.)

圖3 基于S.marinoi轉錄組數(shù)據(jù)的從頭拼接及注釋結果構建的多不飽和脂肪酸生成途徑
Fig.3 Polyunsaturated fatty acid synthesis pathway reconstructed based on thedenovoassembly and annotation ofS.marinoitranscriptome

ACC嚴密控制著脂肪酸從頭合成的速度，是脂肪酸合成過程中的關鍵限速酶[22]。ACC催化生成的一部分丙二酸單酰-CoA存在于質體中用于脂肪酸的從頭合成；另一部分存在于細胞溶膠中用于脂肪酸鏈的延伸及其他次生代謝產(chǎn)物的合成[23]。Roesler等[24]利用基因工程的方法將擬南芥的乙酰-CoA羧化酶基因導入到甘藍型油菜中發(fā)現(xiàn)，轉基因油菜第一代種子中ACC的活性提高了1.7～1.9倍，種子含油量提高了5%左右。Roessler[25]和Dunahay[26]等利用克隆的方法將硅藻的ACC基因經(jīng)修飾后轉化到硅藻自身中后發(fā)現(xiàn)，硅藻ACC的活性提高了2～3倍，脂質的含量小幅度增加。如圖4c所示，ACC的編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期出現(xiàn)顯著上調，S.marinoi生長進入穩(wěn)定期后，細胞生長緩慢，碳代謝流主要轉向脂肪酸的生物合成，細胞開始進行油脂積累。作為脂肪酸合成途徑中的限速酶，ACC編碼基因的上調表達促使更多的乙酰-CoA轉化為丙二酸單酰-CoA而加速脂肪酸生物合成途徑，從而為脂肪酸的合成提供一定的物質保證。本文在S.marinoi轉錄組中還發(fā)現(xiàn)了生物素羧化酶(Biotin Carboxylase, BC)的編碼基因，BC是ACC組成的亞基單元之一，BC的編碼基因在不同生長時期的差異表達情況與ACC的編碼基因基本一致，具體如圖4d所示。

MCAT是肪酸生物合成途徑中的關鍵酶，MCAT的活性與脂肪酸含量的高低密切相關。Cheng等[27]將Schizochytriumsp. TIO1101的MCAT基因在釀酒酵母中過量表達，發(fā)現(xiàn)其生物量和脂肪酸總量分別提高了16.8%和62%。研究者利用基因技術在擬南芥、油菜等植物中過量表達MCAT基因，發(fā)現(xiàn)對C16和C18類脂肪酸的積累有很好的促進作用[28-30]。如圖4e所示，MCAT的編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)顯著上調，間接說明S.marinoi在穩(wěn)定期和衰亡期的脂肪酸合成能力可能要高于指數(shù)期。

脂肪酸從頭合成過程中的另一個關鍵酶是脂肪酸合成酶(FAS)，它催化脂肪酸碳鏈的延長。植物FAS為原核形式的多酶復合體(FASII)，由ACP、KAS(KASI, KASII, KASIII)、KAR、HAD、EAR和OAT構成[31]。

在FAS中，KASIII是當前脂肪酸生物合成積累研究的主要熱點。研究者通過過量表達KASIII基因來調控脂肪酸的生物合成，Dehesh等[32]將菠菜的KASIII基因在煙草、擬南芥、油菜中三種植物中超量表達后發(fā)現(xiàn)，植物體內C16:0脂肪酸的含量增加但脂肪酸合成速率降低。Verwoert等[33]將E.coli的KASIII基因在油菜籽中超量表達后也得到了類似的結果：脂肪酸的組成雖然發(fā)生了變化，但脂肪酸的含量沒有提高且細胞生長嚴重受阻。上述現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與植物FAS是多酶復合體有關，每個亞基的表達活性與其他亞基相互依存，相互制約[34]。在脂肪酸的生物合成中FAS基因的調控機制十分復雜，但可以明確的是FAS活性提高，有助于促進脂肪酸的生物合成。目前，在國內外的研究中鮮有發(fā)現(xiàn)微藻FAS超量表達的相關報告。

較指數(shù)期相比，F(xiàn)AS中3種酶的5個編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)顯著上調，分別為KASI、KASII、KASIII、KAR以及EARI的編碼基因，差異表達情況具體如圖4f，j所示。S.marinoi在進入穩(wěn)定期后，KASI等5個編碼基因的顯著上調為細胞的油脂積累提供了有利的物質條件，同時，KASI等編碼基因表達的變化體現(xiàn)了S.marinoi能量固定以及儲能代謝途徑的變化，這與藻類在不同生長階段的分子響應有著密切的關系。

(各柱狀圖橫坐標表示不同生長時期：EP，指數(shù)期；SP，穩(wěn)定期；DP，衰亡期?？v坐標表示在以指數(shù)期的表達水平為基準的情況下的f數(shù)值。In each bar chart, the horizontal ordinate represents different growth stages: EP, exponential phase; SP, stationary phase; DP, decline phase. The numbers of vertucal ordinate are thefvalue as a benchmark of EP.)

圖4S.marinoi脂肪酸生物合成途徑中差異表達的基因
Fig.4 Different gene expression involving in fatty acid synthesis

在脂肪酸的碳鏈延長途徑中，發(fā)現(xiàn)有3種酶的4個編碼基因的表達在S.marinoi的不同生長時期表現(xiàn)出顯著差異，其中，HCD、ECR和LACS(Comp17540_c0)的編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)顯著上調，而LACS(Comp14198_c0)的編碼基因在穩(wěn)定和衰亡期則出現(xiàn)顯著下調。HCD等3個編碼基因的上調意味著S.marinoi在進入穩(wěn)定期后可能生成了更多的長鏈脂肪酸，以滿足細胞正常生命活動的需求，而Comp14198_c0編碼基因顯著下調意味著一部分編碼基因表達量的降低，可能會造成相關代謝的減緩。

在脂肪酸的去飽和途徑中，發(fā)現(xiàn)Δ12D的編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)顯著上調(見圖4o)，Δ12D能夠催化油酸形成亞油酸。Δ12D編碼基因的表達量的提高有助于亞油酸的生物合成，而亞油酸是多不飽和脂肪酸合成的重要前體物質，Δ12D編碼基因的上調表達為藻類多不飽和脂肪酸的合成提供了一定的物質保證。

通過對S.marinoi脂肪酸生物合成相關編碼基因在不同生長時期表達量的分析，初步推測在穩(wěn)定期S.marinoi的脂肪酸的生物合成更為旺盛，造成上述結果的原因可能與碳代謝流的競爭有關。在指數(shù)期，培養(yǎng)基中N、P等營養(yǎng)元素較為充足，在營養(yǎng)鹽充足的情況下，微藻細胞生長繁殖快速，致使主要的碳代謝流向了細胞生長；而當微藻的生長進入穩(wěn)定期后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)元素逐漸被耗盡，使微藻的生長處于營養(yǎng)限制的條件下，致使細胞的生長繁殖變緩，促使主要的碳代謝流轉向細胞內物質的積累，例如，部分碳代謝流以乙酰-CoA的形式轉向脂肪酸的生物合成。在S.marinoi的脂肪酸生物合成途徑中，發(fā)現(xiàn)以ACC編碼基因為代表的12個編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)了顯著上調，而CS、ACL和LACS(Comp14198_c0)的編碼基因在不同生長時期出現(xiàn)了顯著下調。在后續(xù)的研究中，將著重加強對這15個編碼基因的研究，計劃利用熒光定量檢測的方法來驗證轉錄組的測序結果，從而分析S.marinoi的脂肪酸生物合成在轉錄水平的調控途徑。通過監(jiān)測S.marinoi脂肪酸生物合成途徑中相關酶的基因表達情況，有助于闡述脂肪酸生物合成的內在分子機制，為微藻的脂肪酸生物合成機制提供一定的理論依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，S.marinoi是中國海域的廣布種，同時，也是一種常見的赤潮引發(fā)種。在對赤潮的研究中，可以將S.marinoi作為典型，對其的生理生化機理進行研究，從而闡明該藻引發(fā)赤潮的發(fā)生、發(fā)展以及消亡的內在分子機制，為赤潮的預警和有效防治提供一定的理論基礎。利用轉錄組數(shù)據(jù)對S.marinoi的代謝網(wǎng)絡進行構建，不但有助于從分子水平了解微藻的生理代謝機制，而且對赤潮的預警和防治提供了新的思路。

3 結語

本研究中對不同生長時期的S.marinoi進行了轉錄組測序，通過分析發(fā)現(xiàn)存在26個與脂肪酸合成相關的酶及33個對應的編碼基因，經(jīng)過序列對比分析發(fā)現(xiàn)，這些編碼基因與假微型海鏈藻有較高的序列一致性，而與三角褐指藻的序列一致性較低。通過比較S.marinoi不同生長時期的轉錄組以及KEGG差異的分析結果，確定了脂肪酸合成途徑中基因的表達差異，發(fā)現(xiàn)在該代謝通路中存在顯著差異表達的基因有15個。與指數(shù)期相比， ACL和LACS(Comp14198_c0)的編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期出現(xiàn)顯著下調表達，而CS的編碼基因僅在穩(wěn)定期出現(xiàn)顯著下調表達。與之相反的是，以ACC編碼基因為代表的12個編碼基因在穩(wěn)定期和衰亡期均出現(xiàn)了顯著上調?；谏鲜鲅芯拷Y果，可以初步推測出S.marinoi在穩(wěn)定期的脂肪酸合成能力高于指數(shù)期。這些信息為海洋微藻脂肪酸生物合成途徑的研究提供了理論基礎，有助于對S.marinoi進行基因改造，提高脂肪酸的合成量。同時，又能為赤潮的防治提供新的思路。

[1] Williams P J L B， Laurens L M L. Microalgae as biodiesel & biomass feedstocks: Review & analysis of the biochemistry， energetics & economics[J]. Energy & Environmental Science， 2010， 3(5): 554-590.

[2] Gouveia L， Oliveira A C. Microalgae as a raw material for biofuels production[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology， 2009， 36(2): 269-74.

[3] Das P， Obbard J P. Incremental energy supply for microalgae culture in a photobioreactor[J]. Bioresource Technology， 2011， 102(3): 2973-8.

[4] Chisti Y. Biodiesel from microalgae[J]. Biotechnol Adv, 2007, 25(3): 294-306.

[5] 高亞輝. 海洋微藻分類生態(tài)及生物活性物質研究[J]. 廈門大學學報(自然科學版)， 2001， 40(2): 566-573. Gao Y H. Studies on taxonomy， ecology and bioactive products of marine microalgae[J]. Journal of Xiamen University (Natural Science) ， 2001， 40(2): 566-573.

[6] 程金鳳， 高亞輝， 梁君榮， 等. 骨條藻的種類與基因多樣性研究進展[J]. 自然科學進展， 2007， 17(5): 586-594. Cheng J X， Gao Y H， Liang J R， et al. Progress ofSkeletonemaspecies and genetic diversity[J]. Progress in Natural Science， 2007， 17(5): 586-594.

[7] Diana Sarno， Kooistra W H C F， Medlin L K， et al. Diversity in the genus skeletonema， (bacillariophyceae). Ii. An assessment of the taxonomy of s. Costatum -like species with the description of four new species 1[J]. Journal of Phycology， 2005， 41(1): 151-176.

[8] Grabherr M G， Haas B J， Yassour M， et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome[J]. Nature Biotechnology， 2011， 29(7): 644-652.

[9] Camacho C, Coulouris G, Avagyan V, et al. BLAST+: architecture and applications[J]. BMC Bioinformatics， 2009， 10(1): 1-9.

[10] G?tz S， Garcíagómez J M， Terol J， et al. High-throughput functional annotation and data mining with the Blast2GO suite[J]. Nucleic Acids Research， 2008， 36(10): 3420-3435.

[11] Kanehisa M， Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes[J]. Nucleic Acids Research， 2000， 28(1): 27-30.

[12] Moriya Y， Itoh M， Okuda S， et al. KAAS: an automatic genome annotation and pathway reconstruction server[J]. Nucleic Acids Research， 2007， 35(suppl 2): 182-185.

[13] Li B， Dewey C N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome[J]. BMC Bioinformatics， 2011， 12(1): 93-99.

[14] 荊曉麗， 米鐵柱， 甄毓， 等. 基于瑪氏骨條藻(Skeletonemamarinoi)轉錄組的氮代謝途徑解析[J]. 海洋環(huán)境科學， 2016， 35(5): 703-711. Jing X L， Mi T Z， Zhen Y， et al. Description of nitrogen metabolism pathway based onSkeletonemamarinoitranscriptome[J]. Marine Environmental Science ， 2016， 35(5): 703-711.

[15] 劉乾， 米鐵柱， 甄毓， 等. 基于瑪氏骨條藻(Skeletonemamarinoi)轉錄組的碳固定代謝途徑分析[J]. 科學通報， 2016(22): 2483-2493. Liu Q， Mi T Z， Zhen Y， et al. Description of carbon fixation pathway based onSkeletonemamarinoitranscriptome[J]. Chinese Science Bulletin， 2016(22): 2483-2493.

[16] Anders S， Huber W. Differential expression analysis for sequence count data[J]. Genome Biol， 2010， 11(10): R106.

[17] Trapnell C， Williams B A， Pertea G， et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation[J]. Nature Biotechnology， 2010， 28(5): 511-515.

[18] Dillies M A， Rau A， Aubert J， et al. A comprehensive evaluation of normalization methods for Illumina high-throughput RNA sequencing data analysis[J]. Briefings in Bioinformatics， 2013， 14(6): 671-683.

[19] Storey J D， Tibshirani R. Statistical significance for genomewide studies[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2003， 100(16): 9440-9445.

[20] 童晉. 油菜檸檬酸合酶與檸檬酸裂解酶基因克隆及功能研究[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學院， 2009. Tong J. Cloning and Functional Research of Citrate Synthase and ATP-Citrate Lyase of Brassica Napus[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2009.

[21] Fatland B L， Nikolau B J， Wurtele E S. Reverse genetic characterization of cytosolic acetyl-CoA generation by ATP-citrate lyase in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2005， 17(1): 182-203.

[22] Ohlrogge J B， Jaworski J G. Regulation of fatty acid synthesis[J]. Plant Biology， 1997， 48(48): 109-136.

[23] Nikolau B J， Ohlrogge J B， Wurtele E S. Plant biotin-containing carboxylases [J]. Archives of Biochemistry & Biophysics， 2003， 414(2): 211-22.

[24] Roesler K， Shintani D， Savage L， et al. Targeting of the Arabidopsis homomeric acetyl-coenzyme A carboxylase to plastids of rapeseeds[J]. Plant Physiology， 1997， 113(1): 75-81.

[25] Roessler P G， Ohlrogge J B. Cloning and characterization of the gene that encodes acetyl-coenzyme A carboxylase in the alga Cyclotella cryptica[J]. Journal of Biological Chemistry， 1993， 268(26): 19254-19259.

[26] Dunahay T G， Jarvis E E， Roessler P G. Genetic transformation of the diatoms cyclotella cryptica， and navicula saprophila[J]. Journal of Phycology， 1995， 31(6): 1004-1012.

[27] Cheng R， Ge Y， Yang B， et al. Cloning and functional analysis of putative malonyl-CoA: acyl-carrier protein transacylase gene from the docosahexaenoic acid-producer Schizochytrium sp. TIO1101[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2013， 29(6): 959-967.

[28] Eccleston V S， Ohlrogge J B. Expression of lauroyl-acyl carrier protein thioesterase in Brassica napus seeds induces pathways for both fatty acid oxidation and biosynthesis and implies a set point for triacylglycerol accumulation[J]. Plant Cell， 1998， 10(10): 613-22.

[29] Bonaventure G， Ohlrogge J B. Differential regulation of mRNA levels of acyl carrier protein isoforms in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2002， 128(1): 223-35.

[30] Jha J K， Sinha S， Maiti M K， et al. Functional expression of an acyl carrier protein (ACP) from Azospirillum brasilense alters fatty acid profiles in Escherichia coli and Brassica juncea[J]. Plant Physiology & Biochemistry Ppb， 2007， 45(6-7): 490-500.

[31] 盧善發(fā). 植物脂肪酸的生物合成與基因工程[J]. 植物學報， 2000， 17(6): 481-491. Lu S F. Fatty acid biosynthesis and genetic engineering of plants[J]. Bulletin of Botany， 2000， 17(6): 481-491.

[32] Dehesh K， Tai H， Edwards P， et al. Overexpression of 3-ketoacyl-acyl-carrier protein synthase IIIs in plants reduces the rate of lipid synthesis[J]. Plant Physiology， 2001， 125(2): 1103-14.

[33] Verwoert I I G S， Linden K H V D， Walsh M C， et al. Modification of Brassica napus， seed oil by expression of the Escherichia coli fabH， gene， encoding 3-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III[J]. Plant Molecular Biology， 1995， 27(5): 875-86.

[34] 朱順妮， 王忠銘， 尚?；?， 等. 微藻脂肪合成與代謝調控[J]. 化學進展， 2011， 23(10): 2169-2176. Zhu S N， Wang Z M， Shang C H， et al. Lipid biosynthesis and metabolic regulation in microalgae[J]. Progress in Chemistry, 2011， 23(10): 2169-2176.