于 磊， 劉炳艦， 劉進(jìn)賢

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071； 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

生物與其所生存的環(huán)境密不可分。在本地環(huán)境的選擇壓力下，本地群體會(huì)進(jìn)化出與其生存環(huán)境相適應(yīng)的表型特征，更好地適應(yīng)本地環(huán)境，這就是“本地適應(yīng)性”(Local adaptation)[1]。闡明本地適應(yīng)性發(fā)生的程度和動(dòng)態(tài)，能夠加深對(duì)于生物多樣性的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也可以為生物資源的保護(hù)提供參考[2]。

早期本地適應(yīng)性研究多采用候選基因法。研究者從已知生物學(xué)功能的編碼蛋白質(zhì)的基因入手，通過(guò)群體遺傳學(xué)分析檢測(cè)本地適應(yīng)性的信號(hào)[3-6]。該方法能夠成功的關(guān)鍵在于目標(biāo)候選基因的選擇，然而準(zhǔn)確地選擇合適的基因在實(shí)際操作中難度極大。除此之外，候選基因法也很難應(yīng)用到非模式生物的研究中。由于技術(shù)方法的束縛，關(guān)于生物種群本地適應(yīng)性的研究進(jìn)展緩慢。近年來(lái)，隨著二代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing technology)的迅猛發(fā)展，基于全基因組掃描的方法被應(yīng)用到生物種群本地適應(yīng)性的研究中。該方法可以開(kāi)發(fā)大量單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(Single nucleotide polymorphism, SNP)，大大促進(jìn)了該領(lǐng)域的發(fā)展。SNP標(biāo)記主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記具有在基因組中數(shù)量多，分布密度高等特點(diǎn)，而且在基因分型過(guò)程中不需要根據(jù)片段大小將DNA分帶，可以大規(guī)模地高度自動(dòng)化地完成，相比微衛(wèi)星標(biāo)記工作效率更高，更適于大樣本量檢測(cè)分析，SNP標(biāo)記的使用是群體遺傳學(xué)研究的一大突破[7]。研究者可以使用整個(gè)基因組范圍內(nèi)大量的SNP標(biāo)記進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，對(duì)種群遺傳學(xué)參數(shù)的解析力度驟增(例如，基因流和有效群體大小)。除此之外，基于全基因組掃描的方法在非模式生物的研究中體現(xiàn)出基于候選基因的方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)。目前，基于二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)生物種群本地適應(yīng)性的研究開(kāi)發(fā)了大量離散遺傳位點(diǎn)(Outlier markers)，已經(jīng)在多種海洋生物中檢測(cè)到了適應(yīng)性分化的信號(hào)，例如：大西洋鱈魚(yú)(Gadusmorhua)[8-9]、大西洋鯡魚(yú)(Clupeaharengus)[10-11]和太平洋七鰓鰻(Entosphenustridentatus)[12]等。然而，對(duì)于存在中性遺傳分化的物種，在離散遺傳位點(diǎn)上檢測(cè)到的生物種群的遺傳結(jié)構(gòu)是中性力量和自然選擇力量共同作用的結(jié)果，很難準(zhǔn)確解讀適應(yīng)性分化的模式[13]。

日本鰻鱺(Anguillajaponica)隸屬于鰻鱺目(Anguilliformes)鰻鱺科(Anguillidae)鰻鱺屬(Anguilla)，是一種長(zhǎng)距離降海洄游性魚(yú)類[14]。成魚(yú)廣泛分布于東亞河口和淡水河流，在日本、中國(guó)，以及朝鮮半島都有分布[15]。日本鰻鱺的產(chǎn)卵場(chǎng)位于馬里亞納群島的西部海域(大致為15°N, 140°E)[16]，孵化后的柳葉鰻(Leptocephalus)隨海流漂流至東亞各國(guó)沿海，進(jìn)而抵達(dá)河口水域，變態(tài)為玻璃鰻(Glass eel)[17]。而后經(jīng)過(guò)復(fù)雜的變態(tài)發(fā)育，成體在淡水河流中生活。從1980年代開(kāi)始，日本鰻鱺的種群衰退不斷加劇。玻璃鰻(Glass eel)、黃鰻(Yellow eel)以及銀鰻(Silver eel)的野生群體資源量均出現(xiàn)了嚴(yán)重衰退[18]。在2016年公布的IUCN瀕危物種紅色名錄中，日本鰻鱺已經(jīng)被列為“瀕危”[19]。雖然目前已經(jīng)可以人工育成日本鰻鱺的玻璃鰻幼體[20]，但是由于尚未攻克玻璃鰻幼體餌料的難題，因此人工育成的幼苗成活率低，活性弱，尚無(wú)法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，日本鰻鱺的養(yǎng)殖仍然主要依靠從自然海域捕獲野生幼苗。隨著日本鰻鱺野生資源的衰退，鰻鱺市場(chǎng)受到巨大的沖擊。目前研究表明，水利設(shè)施建設(shè)、過(guò)度捕撈、環(huán)境棲息地的破壞，以及全球氣候變化等都可能是造成鰻鱺種群衰退的原因，然而這些因素對(duì)鰻鱺資源量影響的強(qiáng)度和機(jī)制尚不明確[21]。日本鰻鱺作為隨機(jī)交配物種[22-25]的典型代表，各地理群體均為同一基因庫(kù)隨機(jī)分配，并不存在中性遺傳分化。因此在離散位點(diǎn)上檢測(cè)到的群體間遺傳分化的信號(hào)是其單一世代內(nèi)受自然選擇作用的結(jié)果。這使其成為研究本地適應(yīng)性問(wèn)題的理想材料。

在本研究中，我們利用酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA測(cè)序(Restriction site-associated DNA sequencing, RAD-Seq)技術(shù)開(kāi)發(fā)日本鰻鱺多態(tài)性離散SNP標(biāo)記，并通過(guò)KASPar(KBiosciences Competitive Allele-Specific PCR genotyping system)技術(shù)進(jìn)行SNP位點(diǎn)的多態(tài)性驗(yàn)證及在兩個(gè)群體中開(kāi)展初步群體遺傳學(xué)分析。相關(guān)SNP標(biāo)記可以用于未來(lái)日本鰻鱺群體遺傳結(jié)構(gòu)的解析以及種群適應(yīng)本地環(huán)境機(jī)制的研究。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和和DNA提取

在福建寧德市三沙鎮(zhèn)(SS)和遼寧丹東市(DD)向當(dāng)?shù)貜氖脉犆绮稉谱鳂I(yè)的漁民購(gòu)買日本鰻鱺的玻璃鰻樣品(SS，2014年3月，36尾；DD，2014年5月，30尾)，保存于95%的酒精中。DNA提取采用傳統(tǒng)方法。首先用蛋白酶K消化肌肉組織，然后使用苯酚-氯仿法抽提DNA。

1.2 SNP開(kāi)發(fā)

從兩個(gè)群體各選取12尾玻璃鰻樣品進(jìn)行RAD-seq。文庫(kù)構(gòu)建和RAD-seq的具體實(shí)施參照了張柏東等[26]發(fā)表的論文。每個(gè)樣本RAD-seq獲得的總讀長(zhǎng)至少達(dá)到1×基因組(約1.2G)深度。原始數(shù)據(jù)按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過(guò)濾：1.去除有接頭污染的序列；2.去除未識(shí)別堿基大于或者等于10%的序列；3.去除phred值小于5的堿基占總序列長(zhǎng)度大于或者等于50%的序列；4.去除文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的重復(fù)序列；5.去除序列上沒(méi)有EcoRI酶切位點(diǎn)(AATTC)的序列。將過(guò)濾后的序列根據(jù)個(gè)體特異的標(biāo)簽序列進(jìn)行歸類。使用BWA 0.5.9將序列比對(duì)到日本鰻鱺的基因組草圖上[27]，參數(shù)使用默認(rèn)值(Mismatch penalty 4；Gap open penalty 6)[28]。使用SAMTOOLS[29]獲取SNP位點(diǎn)的信息。

使用ARLEQUIN 3.5[30]篩選可能受到自然選擇作用的位點(diǎn)。該軟件可以繪制遺傳距離FST值關(guān)于雜合度的散點(diǎn)圖，將其與模擬的中性分布進(jìn)行對(duì)比來(lái)進(jìn)行離散位點(diǎn)的篩選。中性分布使用雙島嶼模型(Two-island model)進(jìn)行模擬，假設(shè)自由交配[31]。

1.3 多態(tài)性驗(yàn)證

SNP分型由艾吉析科技(上海)有限公司完成。該公司使用KASPar技術(shù)對(duì)丹東群體的30尾玻璃鰻樣品和三沙群體的31尾玻璃鰻樣品進(jìn)行SNP分型。KASPar技術(shù)基于競(jìng)爭(zhēng)性位點(diǎn)特異性PCR擴(kuò)增技術(shù)，將正向引物的3’末端設(shè)計(jì)在SNP位點(diǎn)上，同一位點(diǎn)的兩個(gè)不同等位基因被擴(kuò)增為攜帶不同熒光顏色的產(chǎn)物。每個(gè)SNP位點(diǎn)所使用的特異性引物信息見(jiàn)表 1。

使用ARLEQUIN 3.5計(jì)算觀測(cè)雜合度(Ho)，期望雜合度(He)。使用GENEPOP 4.5.1[32]檢驗(yàn)哈溫平衡和連鎖不平衡，顯著性水平用Bonferroni方法進(jìn)行校正。使用ARLEQUIN 3.5計(jì)算兩群體間的遺傳距離FST值，顯著性水平通過(guò)10 000次重抽樣模擬(Bootstrapping permutations)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 RAD-seq過(guò)濾結(jié)果

在RAD-seq過(guò)程中，最終產(chǎn)出42.1Gb原始數(shù)據(jù)，MS25個(gè)體的原始數(shù)據(jù)量達(dá)到6×基因組(約1.2G)深度，其余個(gè)體的數(shù)據(jù)量達(dá)到1×基因組(約1.2G)深度，Q20比例基本都在90%以上。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾后，共產(chǎn)出40.0Gb高質(zhì)量數(shù)據(jù)，平均每個(gè)樣本1.67Gb數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，數(shù)據(jù)量較大，滿足后續(xù)分析需要。

2.2 SNP開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證

基于RAD-seq的數(shù)據(jù)共獲得73 557個(gè)SNP位點(diǎn)的信息。ARLEQUIN離散位點(diǎn)檢驗(yàn)中，使用R軟件處理ARLEQUIN軟件輸出的文本文件，選取FST值達(dá)到99.5%分位數(shù)以上的位點(diǎn)作為候選位點(diǎn)，共有250個(gè)。在這些位點(diǎn)中，有85個(gè)SNP位點(diǎn)可以成功地進(jìn)行功能注釋，涉及到多個(gè)方面的生物學(xué)功能。由于能成功進(jìn)行功能注釋的位點(diǎn)更有可能在生物的本地適應(yīng)性中發(fā)揮作用，因此使用KASPar技術(shù)對(duì)其中48個(gè)能進(jìn)行功能注釋的位點(diǎn)進(jìn)行SNP分型。有6個(gè)位點(diǎn)未分型成功，2個(gè)位點(diǎn)的數(shù)據(jù)缺失率大于15%，最終有40個(gè)位點(diǎn)的數(shù)據(jù)可用。在本研究中，同一位點(diǎn)2個(gè)不同等位基因擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別被HEX和FAM標(biāo)記，根據(jù)2種熒光信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行SNP分型，熒光信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)，分型結(jié)果清晰。

2.3 遺傳標(biāo)記信息

在這40個(gè)SNP位點(diǎn)中，2個(gè)位點(diǎn)具有單態(tài)性，AJ_SNP_06位點(diǎn)在丹東群體和三沙群體中均只檢測(cè)到胞嘧啶脫氧核糖核苷酸(C)一種等位基因，而AJ_SNP_08只檢測(cè)到腺嘌呤脫氧核糖核苷酸(A)一種等位基因。其余38個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，在丹東(DD)群體中，這38個(gè)位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度(Ho)為0～0.407，期望雜合度(He)為0.033～0.484；在三沙(SS)群體中，這38個(gè)位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度(Ho)為0.032～0.500，期望雜合度(He)為0.032～0.494。具體信息見(jiàn)表 2。經(jīng)過(guò)Bonferroni方法校正，在丹東(DD)群體中，AJ_SNP_03位點(diǎn)偏離哈溫平衡，所有的位點(diǎn)間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。在三沙(SS)群體中，AJ_SNP_25位點(diǎn)和AJ_SNP_35位點(diǎn)偏離哈溫平衡，所有位點(diǎn)間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。綜上，這38個(gè)SNP標(biāo)記具有較高的多態(tài)性，且未檢測(cè)到偏離哈溫平衡或出現(xiàn)連鎖不平衡，因此符合群體遺傳學(xué)分析的需要，可用于解析日本鰻鱺的群體遺傳結(jié)構(gòu)。而且這些標(biāo)記均可定位到日本鰻鱺基因組草圖上，研究者可根據(jù)自己的需要選擇SNP分型方法。丹東群體和三沙群體間的遺傳距離FST值為-0.005(P=0.898)，表明這2個(gè)群體間并無(wú)顯著的遺傳分化。

3 討論

遺傳多樣性是生物與環(huán)境長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果，也是生物適應(yīng)生存環(huán)境的基礎(chǔ)。一般認(rèn)為，遺傳多樣性水平越高，生物應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的能力越強(qiáng)，反之亦然[33]。生物遺傳多樣性的水平通過(guò)分子標(biāo)記來(lái)評(píng)估，目前微衛(wèi)星標(biāo)記和SNP標(biāo)記是最流行的2種分子標(biāo)記。與微衛(wèi)星標(biāo)記相比，SNP標(biāo)記在分型的準(zhǔn)確性以及數(shù)據(jù)處理的自動(dòng)化等方面更具優(yōu)勢(shì)[34]。本研究開(kāi)發(fā)的38個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn)，在丹東(DD)群體中的觀測(cè)雜合度(Ho)為0～0.407，期望雜合度(He)為0.033～0.484；在三沙(SS)群體中的觀測(cè)雜合度(Ho)為0.032～0.500，期望雜合度(He)為0.032～0.494。日本鰻鱺的這些SNP標(biāo)記的雜合度并未出現(xiàn)顯著降低，與其他海洋魚(yú)類的雜合度水平相當(dāng)。在隆頭魚(yú)(Ctenolabrusrupestris)中，SNP標(biāo)記的期望雜合度(He)為0.063～0.495[35]；在大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)中，SNP標(biāo)記的期望雜合度(He)為0.066～0.503[36]；在歐洲川鰈(Platichthysflesus)中，SNP標(biāo)記的期望雜合度(He)為0.176～0.600[37]。結(jié)果表明，盡管日本鰻鱺的種群資源嚴(yán)重衰退，然而群體遺傳多樣性水平并未出現(xiàn)顯著降低。但是這并不意味著日本鰻鱺的資源狀況良好，而有可能與海洋魚(yú)類的生活史策略(Life history strategy)相關(guān)。日本鰻鱺為r-對(duì)策者，繁殖大量子代，但子代存活率低。因此即使種群遭遇瓶頸，子代可能依然會(huì)保持較高的遺傳多樣性水平。然而，日本鰻鱺的資源衰退已十分嚴(yán)重，若不加強(qiáng)對(duì)日本鰻鱺種群資源的保護(hù)，其資源狀況可能陷入惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致日本鰻鱺物種的滅絕。

探究生物不同地理群體的遺傳結(jié)構(gòu)，不僅可以加深對(duì)生物多樣性的認(rèn)識(shí)，也是合理有效地管理生物資源的基礎(chǔ)。目前對(duì)海洋魚(yú)類群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究大多采用中性遺傳標(biāo)記，這些研究的結(jié)果表明，很多海洋魚(yú)類不同地理群體間并不存在顯著的遺傳分化。使用離散位點(diǎn)標(biāo)記進(jìn)行研究，可以揭示更精細(xì)的群體遺傳結(jié)構(gòu)[38-39]。本研究開(kāi)發(fā)的SNP標(biāo)記是根據(jù)丹東群體和三沙群體RAD-seq的數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的兩群體間高FST值標(biāo)記，因此在解析日本鰻鱺群體遺傳結(jié)構(gòu)時(shí)會(huì)具有更高的分辨率。在本研究中，基于38個(gè)SNP標(biāo)記的丹東群體和三沙群體間的遺傳距離FST值為-0.005(P= 0.898)，且不顯著，表明這2個(gè)群體間并無(wú)顯著的遺傳分化。這可能與日本鰻鱺隨機(jī)交配[22-25]的生物學(xué)特征有關(guān)。日本鰻鱺性成熟后會(huì)洄游到共同的產(chǎn)卵場(chǎng)進(jìn)行繁殖，不同地理群體是從同一基因庫(kù)隨機(jī)分配而來(lái)，因此遺傳組成并無(wú)顯著差異。然而，本研究開(kāi)發(fā)的SNP標(biāo)記是兩群體間高FST值的標(biāo)記，應(yīng)當(dāng)具有更高的解析力。這2個(gè)群體間之所以出現(xiàn)小而不顯著的FST值，可能是由于開(kāi)發(fā)SNP時(shí)采用的樣本量較小。開(kāi)發(fā)SNP標(biāo)記時(shí)選取的是小樣本，丹東群體和三沙群體各12尾，而后采用大樣本進(jìn)行SNP分型。小樣本檢測(cè)到的離散位點(diǎn)可能包含統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差，導(dǎo)致同樣的SNP標(biāo)記在大樣本中開(kāi)展群體遺傳學(xué)分析時(shí)不能檢測(cè)到顯著的遺傳分化。此外，由于SNP標(biāo)記只有2個(gè)等位基因，需通過(guò)使用大量標(biāo)記來(lái)提高其對(duì)群體遺傳結(jié)構(gòu)的解析力，因此本研究中分析的SNP位點(diǎn)較少也可能是檢測(cè)到的遺傳分化水平低的原因。

除了用于研究群體遺傳結(jié)構(gòu)，離散位點(diǎn)標(biāo)記對(duì)于本地適應(yīng)性研究也十分重要。日本鰻鱺作為隨機(jī)交配物種[22-25]的典型代表，各地理群體均為同一基因庫(kù)隨機(jī)分配，并不存在中性遺傳分化。因此在離散位點(diǎn)上檢測(cè)到的群體間分化的信號(hào)為其單一世代內(nèi)受自然選擇作用的結(jié)果。這使其成為研究本地適應(yīng)性問(wèn)題的理想材料。目前已有研究使用SNP標(biāo)記對(duì)鰻鱺屬魚(yú)類的本地適應(yīng)性開(kāi)展研究[40-42]，然而SNP標(biāo)記資源在日本鰻鱺中尚屬空白。本研究首次通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了一批離散SNP標(biāo)記，這些SNP標(biāo)記是基于丹東群體和三沙群體篩選的高FST值的分子標(biāo)記，有可能與參與日本鰻鱺對(duì)本地環(huán)境的適應(yīng)，因此可以作為候選分子標(biāo)記應(yīng)用到日本鰻鱺的本地適應(yīng)性研究中，對(duì)深入理解微時(shí)間尺度內(nèi)生物的適應(yīng)性進(jìn)化問(wèn)題具有重要意義。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究首次通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)了一批離散SNP標(biāo)記。這些標(biāo)記大多符合哈溫平衡，且標(biāo)記間不存在連鎖不平衡現(xiàn)象，符合群體遺傳學(xué)分析的要求，可用于解析日本鰻鱺的群體遺傳結(jié)構(gòu)。另外，這些SNP標(biāo)記是基于丹東群體和三沙群體篩選的高FST值的分子標(biāo)記，極有可能與參與日本鰻鱺對(duì)本地環(huán)境的適應(yīng)，因此可以作為候選分子標(biāo)記應(yīng)用到日本鰻鱺的本地適應(yīng)性研究中。

致謝：感謝李玉龍?jiān)跀?shù)據(jù)處理中給予的幫助。

[1] Williams G C. Adaptation and Natural Selection[M]. New Jersey: Princeton University Press, 1966: 20-55.

[2] Hauser L, Carvalho G R. Paradigm shifts in marine fisheries genetics: ugly hypotheses slain by beautiful facts[J]. Fish Fish, 2008, 9: 333-362.

[3] Hemmer-Hansen J, Nielsen E E, Frydenberg J, et al. Adaptive divergence in a high gene flow environment:Hsc70 variation in the European flounder (PlatichthysflesusL.)[J]. Heredity, 2007, 99: 592-600.

[4] Gaggiotti O E, Bekkevold D, Jorgensen H B H, et al. Disentangling the effects of evolutionary, demographic, and environmental factors influencing genetic structure of natural populations: Atlantic herring as a case study[J]. Evolution, 2009, 63: 2939-2951.

[5] Larmuseau M H D, Vancampenhout K, Raeymaekers J A M, et al. Differential modes of selection on therhodopsingene in coastal Baltic and North Sea populations of the sand goby,Pomatoschistusminutus[J]. Mol Ecol, 2010, 19: 2256-2268.

[6] Andersen O, De Rosa MC, Pirolli D, et al. Polymorphism, selection and tandem duplication of transferrin genes in Atlantic cod (Gadusmorhua) - Conserved synteny between fish monolobal and tetrapod bilobal transferrin loci[J]. Bmc Genet, 2011, 12: 51. doi: 10. 1186/1471-2156-12-51.

[7] Allendorf. Genetics and the conservation of natural populations: allozymes to genomes[J]. Mol Ecol, 2017, 26: 420-430.

[8] Moen T, Hayes B, Nilsen F, et al. Identification and characterisation of novel SNP markers in Atlantic cod: Evidence for directional selection[J]. Bmc Genet, 2008, 9: 18. doi: 10. 1186/1471-2156-9-18.

[9] Nielsen E E, Hemmer-Hansen J, Poulsen N A, et al. Genomic signatures of local directional selection in a high gene flow marine organism; the Atlantic cod (Gadusmorhua)[J]. Bmc Evol Biol, 2009, 9: 276. doi: 10. 1186/1471-2148-9-276.

[10] Lamichhaney S, Barrio A M, Rafati N, et al. Population-scale sequencing reveals genetic differentiation due to local adaptation in Atlantic herring[J]. P Natl Acad Sci USA, 2012, 109: 19345-19350.

[11] Limborg M T, Helyar S J, de Bruyn M, et al. Environmental selection on transcriptome-derived SNPs in a high gene flow marine fish, the Atlantic herring (Clupeaharengus)[J]. Mol Ecol, 2012, 21: 3686-3703.

[12] Hess J E, Campbell N R, Close D A, et al. Population genomics of Pacific lamprey: adaptive variation in a highly dispersive species[J]. Mol Ecol, 2013, 22: 2898-2916.

[13] Flatt T. Genomics of clinal variation inDrosophila: disentangling the interactions of selection and demography[J]. Mol Ecol, 2016, 25: 1023-1026.

[14] 張春光, 唐文喬，劉東，等.中國(guó)動(dòng)物志(硬骨魚(yú)綱/鰻鱺目、背棘魚(yú)目)[M].北京：科學(xué)出版社，2010. Zhang C G, Tang W Q, Liu D, et al. Fauna Sinica (Osteichthyes: Anguilliformes, Notacanthiformes)[M]. Beijing: Science Press, 2010.

[15] Tesch F W. The Eel: Biology and Management of Anquillid Eels[M]. London: Chapman & Hall, 1977.

[16] Tsukamoto K. Discovery of the spawning area for Japanese eel[J]. Nature, 1992, 356: 789-791.

[17] Tseng M C, Tzeng W N, Lee S C. Population genetic structure of the Japanese eelAnguillajaponicain the northwest Pacific Ocean: evidence of non-panmictic populations[J]. Mar Ecol Prog Ser, 2006, 308: 221-230.

[18] Tatsukawa. Eel Resources in East Aisa. In: Yamauchi K (ed) Eel Biology[M]. 1st edn. Tokyo: Springer-Verlag, 2003: 293-298.

[19] Jacoby D,Gollock M.The IUCN Red List of Threatened species[EB/OL].(2016-03-01)[2017-04-25].http://www.incnredlist.org/details/166184/0: IUCN,2014.

[20] Nomura K, Ozaki A, Morishima K, et al. A genetic linkage map of the Japanese eel (Anguillajaponica) based on AFLP and microsatellite markers[J]. Aquaculture, 2011, 310: 329-342.

[21] Dekker W. Status of European eel stock and fisheries. In: Yamauchi K (ed) Eel Biology[M]. Tokyo: Springer Verlag, 2003: 237-254.

[22] Sang T K, Chang H Y, Chen C T, et al. Population-structure of the Japanese eel,Anguilla-japonica[J]. Mol Biol Evol, 1994, 11: 250-260.

[23] Ishikawa S, Aoyama J, Tsukamoto K, et al. Population structure of the Japanese eelAnguillajaponicaas examined by mitochondrial DNA sequencing[J]. Fisheries Sci, 2001, 67: 246-253.

[24] Han Y S, Hung C L, Liao Y F, et al. Population genetic structure of the Japanese eelAnguillajaponica: panmixia at spatial and temporal scales[J]. Mar Ecol Prog Ser, 2010, 401: 221-232.

[25] Minegishi Y, Aoyama J, Yoshizawa N, et al. Lack of genetic heterogeneity in the Japanese eel based on spatiotemporal sampling[J]. Coast Mar Sci, 2012, 35: 269-276.

[26] Zhang B D, Xue D X, Wang J, et al. Development and preliminary evaluation of a genomewide single nucleotide polymorphisms resource generated by RAD-seq for the small yellow croaker (Larimichthyspolyactis)[J]. Mol Ecol Resour, 2016, 16: 755-768.

[27] Henkel C V, Dirks R P, de Wijze D L, et al. First draft genome sequence of the Japanese eel,Anguillajaponica[J]. Gene, 2012, 511: 195-201.

[28] Li H, Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform[J]. Bioinformatics, 2010, 26: 589-595.

[29] Li H, Handsaker B, Wysoker A, et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools[J]. Bioinformatics, 2009, 25: 2078-2079.

[30] Excoffier L, Lischer H E L. Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows[J]. Mol Ecol Resour, 2010, 10: 564-567.

[31] Beaumont M A, Nichols R A. Evaluating loci for use in the genetic analysis of population structure[J]. P Roy Soc B-Biol Sci, 1996, 263: 1619-1626.

[32] Rousset F. GENEPOP′007: a complete re-implementation of the GENEPOP software for Windows and Linux[J]. Mol Ecol Resour, 2008, 8: 103-106.

[33] Frankham R, Briscoe D A, Ballou J D. Introduction to Conservation Genetics[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 2002.

[34] Vignal A, Milan D, Sancristobal M, et al. A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics[J]. Genet Sel Evol, 2002, 34: 275-305.

[35] Jansson E, Taggart J B, Wehner S, et al. Development of SNP and microsatellite markers for goldsinny wrasse (Ctenolabrusrupestris) from ddRAD sequencing data[J]. Conserv Genet Resour, 2016, 8: 201-206.

[36] Wang P P, Xiao S J, Han Z F, et al. SNP discovery in large yellow croaker (Larimichthyscrocea) using Roche 454 pyrosequencing sequencing platform[J]. Conserv Genet Resour, 2015, 7: 777-779.

[37] Pedron N, Morvezen R, Moan A L, et al. New set of candidate gene SNPs and microsatellites to disentangle selective and neutral processes shaping population responses of European flounder (Platichthysflesus) to anthropogenic stress and contrasted environments[J]. Conserv Genet Resour, 2015, 7: 823-826.

[38] Russello M A, Kirk S L, Frazer K K, et al. Detection of outlier loci and their utility for fisheries management[J]. Evol Appl, 2012, 5: 39-52.

[39] Milano I, Babbucci M, Cariani A, et al. Outlier SNP markers reveal fine-scale genetic structuring across European hake populations (Merlucciusmerluccius)[J]. Mol Ecol, 2014, 23: 118-135.

[40] Gagnaire P A, Normandeau E, Cote C, et al. The genetic consequences of spatially varying selection in the panmictic American eel (Anguillarostrata)[J]. Genetics, 2012, 190: 725-736.

[41] Ulrik M G, Pujolar J M, Ferchaud A L, et al. Do North Atlantic eels show parallel patterns of spatially varying selection?[J]. Bmc Evol Biol, 2014， 14： 138.doi:10.1186/1471-2148-14-138.

[42] Pujolar J M, Jacobsen M W, Als T D, et al. Genome-wide single-generation signatures of local selection in the panmictic European eel[J]. Mol Ecol, 2014, 23: 2514-2528.