張學(xué)松 張謝 葉樺 宋毓飛

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種常見的慢性肝臟疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，通常為遺傳、環(huán)境、代謝、應(yīng)激作用的結(jié)果[1－2]。早期研究顯示，NAFLD與機(jī)體內(nèi)胰島素耐受性密切相關(guān)，同時西方飲食、高飽和脂肪、高果糖在NAFLD發(fā)病中也起到了重要的作用，過多的TG在肝細(xì)胞中堆積是其重要的發(fā)病機(jī)制之一[3]。肝臟脂肪化、血管受壓等導(dǎo)致肝組織缺血、缺氧，可進(jìn)一步引起肝細(xì)胞變性壞死、肝臟纖維組織增生，從而引起組織的代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常[4]。成纖維細(xì)胞生長因子21（FGF21）是近年來新發(fā)現(xiàn)的、由肝臟分泌的一類內(nèi)分泌樣生長因子，通過調(diào)節(jié)機(jī)體的葡萄糖、脂質(zhì)代謝，從而在人體中發(fā)揮著重要作用[5]。前期研究顯示，F(xiàn)GF21在NAFLD患者體內(nèi)明顯上調(diào)，同時與肝臟內(nèi)脂肪含量高度相關(guān)[6]，但FGF21在NAFLD小鼠體內(nèi)的具體作用機(jī)制尚未明確。本研究采用高脂飲食建立NAFLD小鼠模型，同時采用化學(xué)缺氧劑二氯化鈷（Cocl2）進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察急性缺氧對NAFLD小鼠的影響，并初步探討FGF21的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 實驗動物 雄性C57BL/6小鼠30只，SPF級，體重18～22g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供[合格證號：SCXK（浙）2015－0001]，在溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心分籠飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 小鼠FGF21 ELISA試劑盒（廣州百為生物技術(shù)有限公司）；三色染色試劑盒（上海源葉生物技術(shù)有限公司）；Cocl2（美國sigma公司）；Trizol（美國Invitrogen公司，貨號：15596018）；M－MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司，貨號：18080400）；血糖試劑盒（寧波普瑞柏生物技術(shù)有限公司，貨號：GL8360）；TG試劑盒（美國 Beckman Coulter公司，貨號：OSR61118）；TC試劑盒（美國Beckman Coulter公司，貨號：OSR6216E）；ALT試劑盒（美國Beckman Coulter公司，貨號：OSR6107）；Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1340）；c－Jun 氨基末端激酶（JNK）抗體（美國R&D公司，貨號：AF1387）；p－JNK抗體（美國R&D 公司，貨號：AF1205）、FGF21抗體（美國 santa cruz公司，貨號：sc－81946）、X－盒－結(jié)合蛋白－1（XBP－1）抗體（美國 santa cruz公司，貨號：sc－7160）、GAPDH 抗體（美國 santa cruz公司，貨號：sc－47724）、鼠抗兔二抗（美國santa cruz公司，貨號：sc－2358）驢抗兔二抗（美國santa cruz公司，貨號：sc－2315）。

1.1.3 主要儀器 全自動生化分析儀（AU5400型，美國Beckman Coulter公司）；顯微鏡（ECLPSE 80i型，日本Nikon公司）；高速冷凍離心機(jī)（micro21R型，美國Thermo Fisher公司）；超純水（Direct－Q3 型，美國 Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 將30只實驗小鼠分為正常飲食組（control組，給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8周）、高脂飲食組（HFD組，給予高脂飼料喂養(yǎng)8周，熱量比為碳水化合物35%+脂肪51%+蛋白質(zhì)14%）、高脂飲食+Cocl2缺氧處理組（HFD+Cocl2組，給予高脂飼料喂養(yǎng)8周后，在小鼠腹腔注射60mg/kg的Cocl2作用24h），每組10只。經(jīng)上述處理后，小鼠饑餓過夜，通過心臟穿刺的方法收集血樣后處死，收集其肝臟組織。

1.2.2 血清生化指標(biāo)檢測 采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中空腹血糖、TG、TC、ALT水平，采用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中FGF21含量，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 肝臟組織學(xué)染色 處死小鼠后，取各組小鼠相同部位的肝臟組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5μm切片，作HE染色及三色染色。

1.2.4 Q－PCR法檢測肝臟相關(guān)基因的表達(dá) Trizol法提取肝臟組織中的RNA，取1μg的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增，同時設(shè)定RN18s作為內(nèi)參對照，mFGF21 上游引物為 5′－CTGGGGGTCTACCAAGCATA－3′，下游引物為 5′－CACCCAGGATTTGAATGACC－3′。

1.2.5 Western bolt法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 按蛋白裂解液說明書抽提蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，蛋白變性后行SDS－PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法到PVDF膜上，加3%BSA封閉液，室溫下孵育 2h，加FGF21、p－JNK、JNK、XBP－1、GAPDH 一抗（1∶1 000），4℃封閉過夜，棄一抗，Tris－HCl緩沖鹽溶液+吐溫（TBST）洗 3 遍。加 1∶10 000的二抗，室溫孵育2h后，棄二抗，TBST洗3遍。增強化學(xué)熒光發(fā)光法顯影，曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad 5.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食及Cocl2處理后對小鼠體征指數(shù)及代謝的影響 HFD組小鼠喂養(yǎng)8周后，體重、肝臟重量、肝臟體重比及血清中空腹血糖、TC均較control組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1a－c。Cocl2處理后小鼠體重、肝臟重量、肝臟體重比及血清中空腹血糖、TG、TC均高于control組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；其中血清中TG高于HFD組（P＜0.05），見圖1d-f。

圖1 3組小鼠體征指數(shù)及代謝指標(biāo)的比較（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 高脂飲食及Cocl2處理后對小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 HE染色結(jié)果：與control組比較，HFD組、HFD+Cocl2組小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)大量堆積，可見大量脂肪空泡，見圖2a-c。三色染色結(jié)果：與control組比較，HFD組、HFD+Cocl2組小鼠肝臟血管腔內(nèi)纖維化均明顯增多，見圖 2d-f。

圖 2 3 組小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)比較（a、d：control組；b、e：HFD 組；c、f：HFD+Cocl2組）

2.3 高脂飲食及Cocl2處理后對小鼠肝臟損傷及炎癥因子表達(dá)的影響 與control組比較，HFD組、HFD+Cocl2組小鼠血清中肝臟損傷因子ALT水平、炎癥因子基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）mRNA表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05），且HFD+Cocl2組均高于HFD組（均 P＜0.05），見圖 3a-b。control組、HFD 組、HFD+Cocl2組小鼠缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）mRNA表達(dá)水平兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖3c。

2.4 高脂飲食及Cocl2處理后小鼠FGF21表達(dá)的影響 ELISA結(jié)果顯示，與control組比較，HFD組小鼠血清FGF21水平升高，經(jīng)Cocl2處理后血清FGF21水平進(jìn)一步升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖4a；肝臟組織FGF21 mRNA及蛋白表達(dá)變化與血清水平趨勢相同，見4b-c。

2.5 高脂飲食及Cocl2處理小鼠后對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的影響 Western blot結(jié)果顯示，與control組比較，HFD組p-JNK及XBP-1蛋白表達(dá)明顯增多，HFD+Co－ cl2組表達(dá)進(jìn)一步增強，見圖5。

圖3 3組小鼠血清ALT及肝臟組織TIMP-1、HIF-1α mRNA表達(dá)水平的比較（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖4 3組小鼠血清FGF21及肝臟組織FGF21 mRNA表達(dá)水平及蛋白電泳圖的比較（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖5 3組小鼠肝臟JNK、XBP-1信號通路的電泳圖比較

3 討論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制存在較多爭議，目前普遍被接受的是“多次打擊”學(xué)說，涉及到脂肪毒性、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力、慢性炎癥狀態(tài)和線粒體功能障礙等[7-8]。肝臟細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的脂類代謝障礙被認(rèn)為是NAFLD發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)。低氧環(huán)境被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一個重要誘導(dǎo)因素，但關(guān)于誘導(dǎo)的機(jī)制目前仍未明確[9-10]。本研究結(jié)果顯示，與control組比較，HFD組、HFD+Cocl2組小鼠炎癥因子TIMP-1 mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白p-JNK、XBP-1表達(dá)均明顯增加，但HIF-1α mRNA表達(dá)不明顯，可能與缺氧時間較短有關(guān)。因此，筆者推測體內(nèi)的炎癥誘導(dǎo)其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可能是缺氧誘導(dǎo)脂類代謝障礙的另一條調(diào)控途徑，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

FGF21是FGFs家族中目前發(fā)現(xiàn)的唯一沒有促有絲分裂的基因，具有內(nèi)分泌因子的功能，同時參與機(jī)體物質(zhì)代謝，并維持機(jī)體脂肪和糖代謝的平衡[11-12]。Kharitomenkov等[13]證實FGF21在靈長類動物中具有代謝調(diào)控功能，同時還發(fā)現(xiàn)FGF21具有調(diào)控脂蛋白的功能，在治療動脈粥樣硬化中具有重要作用。目前有文獻(xiàn)報道FGF21與肝臟疾病存在一定關(guān)系：Gaemers等[14]的動物實驗結(jié)果表明高脂流體飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝臟中FGF21 mRNA明顯增高；Li等[15]臨床研究報道肝損傷患者外周血中FGF21水平明顯升高，與AST、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶均相關(guān)。本研究結(jié)果表明HFD組小鼠呈現(xiàn)出明顯的脂肪肝病變狀況，血清FGF21水平、肝臟組織FGF21 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高；提示急性缺氧加重了NAFLD小鼠的肝臟損傷，進(jìn)一步上調(diào)了FGF21的表達(dá)。因此，筆者推測小鼠體內(nèi)FGF21水平升高對機(jī)體可能是一種反饋性的保護(hù)作用，它與小鼠肝臟損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

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