賈陽杰 呂亞麗 劉麗宏

[摘要] 目的 探討人巨細胞病毒（HCMV）感染人胚肺成纖維細胞后細胞凋亡情況，以及姜黃素對HCMV感染細胞后細胞凋亡的影響。 方法 將細胞分為細胞對照組（細胞維持液），病毒模型組（細胞維持液+HCMV），姜黃素大（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.8 μg/mL）、中（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.4 μg/mL）、?。毎S持液+HCMV+姜黃素0.2 μg/mL）劑量組，更昔洛韋組（細胞維持液+HCMV+更昔洛韋50 μg/mL），運用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）和熒光染料碘化丙啶（PI）法檢測姜黃素對HCMV感染的細胞凋亡的影響。 結(jié)果 JC-1法實驗結(jié)果顯示：HCMV感染早期，病毒模型組細胞凋亡情況與細胞對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；與病毒模型組比較，更昔洛韋組和姜黃素大、中、小劑量組細胞凋亡顯著增加（P < 0.05）。HCMV感染晚期，與細胞對照組比較，病毒模型組細胞凋亡顯著增加（P < 0.05）；與病毒模型組比較，姜黃素大、中、小劑量組細胞凋亡均有不同程度降低，其中姜黃素大劑量組與病毒模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。熒光染料PI法實驗結(jié)果顯示：在HCMV感染早期及晚期，與細胞對照組比較，病毒模型組S期細胞顯著增多（P < 0.01）；與病毒模型組比較，姜黃素大、中、小劑量組S期細胞均明顯減少（P < 0.05）。 結(jié)論 姜黃素能夠?qū)笻CMV感染引起的細胞凋亡作用，可使HCMV感染早期誘導的抗凋亡作用和HCMV感染晚期誘導的促凋亡作用減弱。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素；人巨細胞病毒；細胞周期；細胞凋亡

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（a）-0004-07

細胞凋亡（apoptosis），又稱程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD）是指細胞主動死亡的現(xiàn)象。機體出現(xiàn)細胞凋亡主要是為了能夠保持組織、器官的正常形態(tài)、功能和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[1]。大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，機體感染人巨細胞病毒（HCMV）后產(chǎn)生的臨床表現(xiàn)，跟PCD的發(fā)生密切相關(guān)[2]。

HCMV是β皰疹病毒亞科的雙鏈線狀DNA病毒。在大多數(shù)發(fā)達國家，大約50%的成年人既往感染HCMV，在世界發(fā)展中地區(qū)，HCMV感染在大齡兒童和成年人群中甚至高達90%～100%[3]。HCMV一旦侵入人體將長期或終身存在于體內(nèi)，正常人一般為潛伏感染或無癥狀的亞臨床感染，而在放化療后、器官移植術(shù)后的腫瘤患者等免疫功能不全或低下的易感人群中，感染HCMV后常常引起多系統(tǒng)的病變，甚至造成致死性的危險[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，HCMV感染后，機體的免疫系統(tǒng)并不能將其全部消滅清除，并且HCMV還可以潛伏于細胞中[5]。HCMV與PCD密切相關(guān)且兩者之間的聯(lián)系較為復雜，研究者發(fā)現(xiàn)，HCMV感染后，在不同的條件下，既可表現(xiàn)為抑制細胞的凋亡，也可表現(xiàn)為加快細胞的凋亡[6]。姜黃素是從姜黃屬中提取出的一種酚性色素，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用。故本研究擬通過運用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）和熒光染料碘化丙啶（PI）的方法來探討HCMV感染人胚肺成纖維細胞后細胞凋亡情況，以及姜黃素對HCMV感染細胞后細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 病毒及細胞

HCMV AD169株由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院婦科和兒科臨床病毒研究室提供。人胚肺成纖維細胞（HELF株）購自國家實驗細胞資源中心，實驗所用細胞為20～25代細胞。

1.2 藥物

注射用更昔洛韋（GCV）（美國Sigma公司，貨號：Y0001129）；姜黃素單體（批號：062-20170321，含量99.116%）由首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院（以下簡稱“我院”）藥事部自制；姜黃飲片來自江西江中中藥飲片有限公司，由我院中草藥房藥師鑒定為真品，批號：160801，GMP證號：贛JX20120017。

1.3 主要試劑及儀器

MEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青霉素G（Penicillin G）、Hank′s液、鏈霉素（Streptomycin）、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）均購自美國Sigma-Aldrich公司；JC-1購自北京泛博生物化學有限公司；PI染色液購自美國Sigma公司；流式細胞儀購自美國BD公司。細胞培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)基+Penicillin G（100 U/mL）+Streptomycin（100 μg/mL）+10%FBS。細胞維持液為MEM培養(yǎng)基+Penicillin G（100 U/mL）+Streptomycin（100 μg/mL）+2%FBS。

1.4 JC-1法檢測細胞凋亡

將HELF細胞在96孔板中培養(yǎng)成單層細胞，將細胞分為六組，分別為細胞對照組（細胞維持液），病毒模型組（細胞維持液+HCMV），姜黃素大劑量組（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.8 μg/mL）、中劑量組（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.4 μg/mL）和小劑量組（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.2 μg/mL）、更昔洛韋組（細胞維持液+HCMV+GCV 50 μg/mL），更昔洛韋為陽性對照藥。病毒感染滴度為100 TCID50/孔，細胞孵育箱中培養(yǎng)1 h后去棄去病毒液。將以上六組細胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于感染早期（≤12 h）和感染晚期（≥48 h）收集細胞，依據(jù)試劑盒說明書操作，進行細胞凋亡檢測。實驗過程至少進行3次。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

將HELF細胞在96孔板中培養(yǎng)成單層細胞后，同步化培養(yǎng)12 h；約100 TCID50/孔病毒滴度感染細胞，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附1～2 h，棄上清；細胞對照組和病毒模型組更換維持液繼續(xù)培養(yǎng)；姜黃素各組終濃度分別為大劑量組（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.8 μg/mL）、中劑量組（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.4 μg/mL）和小劑量組（細胞維持液+HCMV+姜黃素0.2 μg/mL）；更昔洛韋組（細胞維持液+HCMV+GCV 50 μg/mL）。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于感染早期（≤12 h）和感染晚期（≥48 h）收集細胞。將收集的細胞制成單層細胞懸液，用預冷的PBS漂洗2次，1000 r/min離心5 min，加入預冷的70%乙醇，于4℃固定過夜后，PBS洗滌，離心后去除固定液，加PI染色液（含50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.2% Triton X-100）置于4℃避光孵育30 min后即可進行細胞周期分析。實驗過程至少進行3次。

1.6 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t法和Dunnett-t法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞凋亡情況比較

HCMV感染早期，病毒模型組與細胞對照組的細胞凋亡情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；與病毒模型組比較，更昔洛韋組和姜黃素大、中、小劑量組細胞凋亡明顯增加（P < 0.05）。HCMV感染晚期，與細胞對照組比較，病毒模型組細胞凋亡明顯增加（P < 0.05）；與病毒模型組比較，姜黃素大、中、小劑量組細胞凋亡均有不同程度降低，其中姜黃素大劑量組與病毒模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 不同感染時期各組細胞周期情況比較

在HCMV感染早期及晚期，與細胞對照組比較，病毒模型組S期細胞顯著增多（P < 0.01）；與病毒模型組比較，姜黃素大、中、小劑量組S期細胞均明顯減少，而更昔洛韋組S期細胞明顯增多，G0/G1期細胞明顯減少（P < 0.05）。見圖2～3、表1。

3 討論

HCMV感染機體后，感染的細胞一般都處于不同的細胞周期。如果HCMV感染了處于G0/G1期的細胞，則細胞只能進入到G1/S期；如果HCMV感染了處于S期的細胞，則細胞會一直處于S期，表現(xiàn)為停滯狀態(tài)，最終導致細胞的有絲分裂停止[7]。本研究結(jié)果顯示在HCMV感染早期，病毒模型組S期細胞較細胞對照組明顯增多，而處于G0/G1期的細胞較細胞對照組有所減少。隨著感染時間延長，宿主細胞均表現(xiàn)為G2/M期細胞有所減少。經(jīng)過姜黃素干預治療后，姜黃素各劑量組處于S期細胞均明顯少于病毒對照組，G0/G1期細胞均有所增多，細胞凋亡沒有增加。

HCMV感染機體后，機體細胞發(fā)生凋亡，細胞死亡后機體會清除這些細胞，這是機體抵抗病毒感染對機體造成損傷的一種機制。有研究發(fā)現(xiàn)在HCMV感染初期，HCMV為了阻止機體細胞凋亡，會轉(zhuǎn)錄表達某些蛋白以阻止細胞凋亡[8]，從而保證病毒復制增殖能夠順利進行，病毒的這種適應性為其持續(xù)感染創(chuàng)建了有利的環(huán)境。機體感染HCMV后，病毒可能是通過作用于一些調(diào)節(jié)細胞周期的細胞因子從而造成細胞正常周期的改變，比如感染后使細胞內(nèi)細胞周期蛋白E（cyclin E）的表達上調(diào)，使細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKIs）活性均發(fā)生改變等[9]。有研究發(fā)現(xiàn)處于S期的二倍體纖維母細胞感染HCMV后細胞表現(xiàn)出周期停滯，并且還出現(xiàn)病理性有絲分裂[10]。Murphy等[11]的實驗結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。Lunaldi等[12]研究證實抗HCMV抗體與內(nèi)皮細胞激活和凋亡有關(guān)的分子基因程序的表達有關(guān)，可以促進熱休克蛋白60（HSP60）的釋放，這可能是抗HCMV抗體促凋亡的另一分子機制。黃晨等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HCMV可以導致人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖并且使宿主細胞處于G1期的細胞減少，進而推測HCMV感染可能促進了G0/Gl期細胞進入S期和G2/M期，細胞最終表現(xiàn)為增殖。有研究者發(fā)現(xiàn)HCMV感染后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯增多，運用更昔洛韋進行治療后，Bcl-2含量明顯減少，并且HCMV引起的抗凋作用明顯下降[14]。在HCMV病毒感染晚期，病毒對細胞凋亡的抑制作用解除，反而促進細胞發(fā)生凋亡，以便病毒釋放。細胞感染后HCMV可以潛伏于細胞中，造成免疫系統(tǒng)的長期激活，改變免疫狀態(tài)，從而引發(fā)機體產(chǎn)生多種慢性炎癥性疾病[15-16]。HCMV感染機體后患者會表現(xiàn)出視網(wǎng)膜炎，用更昔洛韋治療此類患者后，視網(wǎng)膜上皮細胞凋亡明顯受到抑制。Zhou等[17]發(fā)現(xiàn)，與感染前比較，感染HCMV的平滑肌細胞（SMCs）的增殖明顯提高。2005年，Reinhardt課題組[18]也得到了相同的實驗結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)，HCMV感染SMCs后，細胞內(nèi)p53的含量減少，SMCs的凋亡受到抑制[19]。同時Epstein等[20]也證實了這一點，即HCMV可以調(diào)控SMCs p53的基因表達，從而減少SMCs細胞的凋亡。Liao等[21]研究結(jié)果進一步表明HCMV感染可以影響內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的自然凋亡過程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有顯著抗HCMV的作用[22-23]，但具體機制不清。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠?qū)笻CMV感染引起的細胞凋亡作用，可使HCMV感染早期誘導的抗凋亡作用和HCMV感染晚期誘導的促凋亡作用減弱。

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（收稿日期：2018-04-24 本文編輯：羅喬荔）