肖奕 馬大昌 王紅磊 吉琨 武力

[摘要] 目的 基于ATP7A探討粉防己堿對乳腺癌細(xì)胞順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制。 方法 建立兩種人乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株及ATP7A高表達(dá)細(xì)胞。檢測粉防己堿對順鉑耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用，高效液相色譜測定胞內(nèi)順鉑含量，檢測ATP7A蛋白表達(dá)。 結(jié)果 耐藥乳腺癌細(xì)胞的順鉑敏感性顯著降低（P < 0.05），ATP7A表達(dá)升高（P < 0.05），胞內(nèi)順鉑含量明顯降低（P < 0.05）；ATP7A高表達(dá)細(xì)胞較正常乳腺癌細(xì)胞順鉑敏感性下降（P < 0.05），胞內(nèi)順鉑含量降低（P < 0.05）。而粉防己堿對細(xì)胞耐藥性具有明顯的逆轉(zhuǎn)作用，較耐藥細(xì)胞及轉(zhuǎn)染細(xì)胞可升高胞中順鉑含量（P < 0.05），降低ATP7A表達(dá)（P < 0.05）。 結(jié)論 粉防己堿對人乳腺癌順鉑耐藥細(xì)胞及ATP高表達(dá)細(xì)胞的順鉑耐藥性有逆轉(zhuǎn)作用，其機(jī)制可能與抑制ATP7A表達(dá)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 粉防己堿；乳腺癌；順鉑耐藥；ATP7A

[中圖分類號] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（a）-0018-05

順鉑是乳腺癌化療一線用藥，但耐藥嚴(yán)重影響臨床療效[1-2]。ATP7A參與腫瘤對順鉑的泵出，耐藥乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯增高[3-4]。粉防己堿對腫瘤耐藥具有逆轉(zhuǎn)作用[5-7]，可提高阿霉素在人口腔上皮癌耐藥細(xì)胞中的濃度；與苦參堿聯(lián)用可有效提高多柔比星對乳腺癌的細(xì)胞毒性[8-9]，但對其在乳腺癌順鉑耐藥中的作用有待探究。本研究采用兩種人乳腺癌細(xì)胞株建立順鉑耐藥細(xì)胞及ATP7A高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞，考察粉防己堿對不同順鉑耐藥細(xì)胞的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國）；粉防己堿、順鉑、DMSO（Sigma公司，美國）；BCA蛋白測定試劑盒（碧云天生物研究所，中國）；LipofectamineTM2000（Invivogen，法國）；pCMV6/ATP7A轉(zhuǎn)染試劑（上海吉瑪生物公司，中國）；ATP7A、GAPDH（abcam，英國）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 順鉑耐藥MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞的建立

取對數(shù)生長期MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞，加入終濃度為100 ng/mL的順鉑，培養(yǎng)，傳代；當(dāng)細(xì)胞適應(yīng)后，適當(dāng)增加順鉑濃度（30～50 ng/mL），保證細(xì)胞可穩(wěn)定生存、傳代，6周后得到穩(wěn)定耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP，停用順鉑培養(yǎng)2周后取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[10]。

1.3 pCMV6/ATP7A轉(zhuǎn)染MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞的建立

MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞以每孔1×105/mL密度接種于6孔板中，待鋪滿80%底面積進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)LipofectamineTM2000試劑盒說明書轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒。將質(zhì)粒pCMV6/ATP7A轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞中。質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體的用量每孔分別為1 μg/μL和2 μL。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后48 h，給予順鉑及粉防己堿干預(yù)。

1.4 MTT試驗(yàn)

對數(shù)生長期的MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP乳腺癌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，接種密度為1×105/mL，24 h后加入不同濃度的順鉑（MDA-MB-231/DDP及ATP7A轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞：5、10、20、40、80、160 mg/L；MCF-7/DDP及ATP7A轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞：2.5、5、10、20、30、60 mg/L），每孔總體積為200 μL，再孵育24 h后吸出培養(yǎng)基，加入5 mg/mL的MTT溶液100 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸去MTT液，加入200 μL DMSO，振蕩15 min，490 nm測定吸收值。

1.5 胞內(nèi)順鉑濃度檢測

取MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP、ATP7A轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞及給予粉防己堿預(yù)處理12 h的細(xì)胞，在含有5 μg/mL順鉑培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h，用冷PBS洗2次，2700 r/min離心5 min，高效液相色譜測定胞內(nèi)順鉑含量（順鉑濃度用測定每1×106個(gè)細(xì)胞中順鉑量表示）。色譜條件：色譜柱4.0 mm×150 mm；5 μm的U-Bondapak-C18H37化學(xué)鍵合反相固定相；流動(dòng)相，甲醇-水（80∶20）；流速1 mL/min；檢測波長254 nm[11]。

1.6 Western blot試驗(yàn)

冰預(yù)冷生理鹽水洗收集的細(xì)胞2次，RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白質(zhì)。提取液蛋白質(zhì)濃度用BCA 試劑盒定量。將蛋白提取液用10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，用ATP7A（1∶1000）、GAPDH（1∶1000）單克隆抗體孵育過夜，之后再用具有辣根過氧化物酶的二抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同乳腺癌細(xì)胞對順鉑的敏感度

在同等順鉑給藥劑量下，順鉑對模型細(xì)胞MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP的抑制率較正常乳腺癌細(xì)胞明顯降低（P < 0.05），提示順鉑耐藥細(xì)胞模型建立成功。此外ATP7A高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞在同等順鉑給藥劑量下，與正常乳腺癌細(xì)胞比較抑制率同樣降低（P < 0.05）。見圖1。

2.2 不同乳腺癌細(xì)胞內(nèi)順鉑含量

耐藥MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP細(xì)胞相較于正常乳腺癌細(xì)胞，胞內(nèi)順鉑濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。轉(zhuǎn)染ATP7A的MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞相較于普通乳腺癌細(xì)胞，胞內(nèi)順鉑的濃度同樣顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

2.3 粉防己堿對乳腺癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響

不同濃度（0.5、2.5、10、25 μg/mL）的粉防己堿給予不同順鉑耐藥乳腺癌細(xì)胞。隨著濃度的提高，粉防己堿對乳腺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，10、25 μg/mL粉防己堿對乳腺癌耐藥細(xì)胞具有明顯抑制作用，與對照組（未給予藥物干預(yù)的乳腺癌細(xì)胞）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），見圖3a。將無抑制作用的0.5 μg/mL粉防己堿與不同濃度順鉑（5、20 μg/mL）單獨(dú)或聯(lián)合給予MCF-7/DDP細(xì)胞，可提高等劑量下順鉑在耐藥細(xì)胞中的抑制率（P < 0.05），見圖3b。將無抑制作用的0.5 μg/mL粉防己堿與不同濃度順鉑（20、80 μg/mL）單獨(dú)或聯(lián)合給予MDA-MB-231/DDP細(xì)胞后，明顯提高等劑量下順鉑在耐藥細(xì)胞中的抑制率（P < 0.05），見圖3c。

2.4 粉防己堿對乳腺癌細(xì)胞胞內(nèi)順鉑濃度的影響

給予5 μg/mL的順鉑，粉防己堿干預(yù)后MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP細(xì)胞內(nèi)順鉑濃度較未干預(yù)組顯著升高（P < 0.05）。將粉防己堿給予轉(zhuǎn)染ATP7A的MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)順鉑濃度分別為（19.7±4.1）、（38.9±5.8）ng/（6×106）cells，與單一給予順鉑的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中順鉑濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖4。

2.5 粉防己堿對乳腺癌細(xì)胞ATP7A的影響

pCMV6/ATP7A轉(zhuǎn)染細(xì)胞中ATP7A高表達(dá)，說明轉(zhuǎn)染模型成功，同時(shí)給予粉防己堿后可以明顯抑制其表達(dá)。順鉑耐藥細(xì)胞MDA-MB-231/DDP、MCF-7/DDP中ATP7A較正常細(xì)胞明顯升高（P < 0.05），但給予粉防己堿后，耐藥細(xì)胞中ATP7A表達(dá)明顯降低。見圖5。

3 討論

腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥的主要因素有：細(xì)胞降低對順鉑類藥物的攝??；胞內(nèi)蛋白或者生物小分子使順鉑失活；鉑類物質(zhì)與細(xì)胞中 DNA形成加合物；細(xì)胞自噬促進(jìn)耐藥[13]；以及鉑類藥物被泵出細(xì)胞[12，14-15]，其中泵出細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥最主要的原因。ATP7A是銅泵出蛋白，其表達(dá)水平和順鉑耐藥性在多種腫瘤細(xì)胞中呈正相關(guān)[16]。ATP7A主要分布在人體除肝臟外的大部分組織中[17]。乳腺癌組織中ATP7A表達(dá)較正常組織明顯增高，抑制ATP7A表達(dá)可提高乳腺癌順鉑敏感性[18]。

本研究分別建立兩種順鉑耐藥乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)同劑量順鉑給藥，兩種細(xì)胞順鉑敏感性明顯降低，ATP7A明顯升高，胞中順鉑含量顯著降低；當(dāng)給予粉防己堿后，可以明顯抑制細(xì)胞ATP7A的表達(dá)，顯著升高耐藥細(xì)胞中順鉑含量，有效提高耐藥乳腺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。借助轉(zhuǎn)染技術(shù)高表達(dá)ATP7A后，正常乳腺癌細(xì)胞對順鉑敏感性降低，胞中順鉑含量顯著降低，而給予粉防己堿后可抑制細(xì)胞中ATP7A的表達(dá)，升高細(xì)胞中順鉑含量，其中在MCF-7細(xì)胞中，給予粉防己堿后其細(xì)胞中順鉑含量與正常乳腺癌細(xì)胞無顯著性差異。

粉防己堿是千金藤屬防己科植物粉防己的主要生物活性成分，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[7，19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)粉防己堿可以通過調(diào)節(jié)順鉑耐藥乳腺癌細(xì)胞中ATP7A的表達(dá)，提高該類細(xì)胞順鉑敏感性，該結(jié)果為粉防己堿在腫瘤耐藥治療中的使用提供了新的研究方向。

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（收稿日期：2018-06-19 本文編輯：張瑜杰）