秦培潔 張東偉 高思華 劉劍鋒

[摘要] 目的 觀察姜黃素對高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病模型大鼠肝臟組織蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）、胰島素受體底物-2（IRS-2）mRNA表達(dá)的影響。 方法 SD大鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)后對尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）來制備2型糖尿病模型，將其分層隨機(jī)分為模型組、姜黃素組、吡格列酮組，每組10只。分別在給藥第4、8周后，測定空腹血糖（FBG）、空腹血清胰島素（FINS）、血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，計(jì)算肝臟指數(shù)（LI）、胰島素敏感指數(shù)（ISI）。給藥第8周肝臟HE染色觀察其病理變化，Real-time PCR法檢測肝臟PTP1B、IRS-2 mRNA表達(dá)。 結(jié)果 姜黃素組相較于模型組能夠顯著降低2型糖尿病大鼠的體重、FBG、FINS、LDL-C水平（P < 0.05），增加胰島素敏感性，改善肝臟組織脂肪變性和炎性反應(yīng)，抑制PTP1B mRNA表達(dá)，上調(diào)IRS-2 mRNA表達(dá)（P < 0.05）。 結(jié)論 姜黃素能夠改善2型糖尿病模型大鼠的胰島素抵抗，其作用機(jī)制可能與抑制PTP1B mRNA表達(dá)、上調(diào)IRS-2 mRNA表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素；2型糖尿病；蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B；胰島素受體底物-2

[中圖分類號] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（a）-0014-04

唐代《新修本草》中首載了植物姜黃的功效——破血行氣、通經(jīng)止痛、祛風(fēng)痹痛、消瘡癰腫痛、利膽等?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃中的主要有效成分為姜黃素（curcumin）[1]。姜黃素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種生物學(xué)活性，而近年來對姜黃素的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素還具有降低血糖、改善胰島素抵抗的作用。本研究以高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠為研究對象，應(yīng)用姜黃素對其進(jìn)行干預(yù)，觀察姜黃素對肝臟組織蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）、胰島素受體底物-2（IRS-2）mRNA表達(dá)的影響，探討其改善胰島素抵抗的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

姜黃素粉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%），購自Sigma公司（BC BL0422G）；Trizol RNA提取試劑，購自Invitrogen公司（15596025）；鏈脲佐菌素（STZ），購自Sigma公司（S0129）；吡格列酮片，購自北京太洋藥業(yè)有限公司；SYBR Green PCR Master Mix實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購自BIO-RAD公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，購自Promega公司；引物，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 動物模型制備與分組

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)動物選取SD大鼠60只，3月齡，體重（270±20）g，SPF級，天津醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有動物按照清潔級動物管理標(biāo)準(zhǔn)，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心動物房，光照/黑暗時(shí)間12 h/12 h，室溫恒溫（25±3）°C。

1.2.2 模型制備方法 SD大鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)后對尾靜脈注射STZ來制備2型糖尿病模型。

1.2.3 分組與給藥 ①選取SD雄性大鼠60只，隨機(jī)選取其中50只進(jìn)行4周的高脂高熱卡飼料（高脂飼料配方：蔗糖20%、膽固醇2.5%、豬油10%、膽酸鈉1%、基礎(chǔ)飼料77.5%）喂養(yǎng)，檢測空腹血清胰島素（FINS）水平。②第一步的50只大鼠進(jìn)行8周的高脂高熱卡喂養(yǎng)然后尾靜脈注射STZ，檢測隨機(jī)血糖，如果超過16.9 mmol/L，則視為2型糖尿病模型制備成功（成模率為80%）（40只，高脂組）。③選取造模成功的30只2型糖尿病大鼠分層隨機(jī)（按血糖、體重）分為三組，每組10只，分別為模型組、吡格列酮組、姜黃素組。按照人鼠等效劑量，吡格列酮組、姜黃素組分別給予吡格列酮（人鼠等效劑量為1.35 mg/kg）和姜黃素（人鼠等效劑量為100 mg/kg）[2]，模型組每日用等量無菌飲用水灌胃。④正常組則是普通飼料喂養(yǎng)的SD大鼠10只，每日給予等量無菌飲用水灌胃。⑤待實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第8周時(shí)，處死大鼠，取材、備用。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

藥物干預(yù)8周后股動脈取血，放血處死，分離血清。稱取肝重（濕重），甲醛固定后凍存。

1.3.1 一般狀況 觀察各組大鼠飲食情況、精神狀態(tài)、行為、毛發(fā)光澤度、活動狀態(tài)等。

1.3.2 血脂、空腹血糖（FBG）、FINS、胰島素敏感指數(shù)（ISI）的測定 對大鼠禁食不禁水12 h（8：00 pm～8：00 am），然后取其血，用微量血糖儀測定血糖，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定FINS水平；ISI用李氏法計(jì)算，即ISI=ln[1/（空腹胰島素濃度×空腹血糖濃度）]；采用全自動生化分析儀測定血清血脂，包括血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

1.3.3 肝臟指數(shù) 肝臟指數(shù)（LI）=肝重（濕重）/體重×100%。

1.3.4 病理學(xué)檢查 石蠟切片，HE染色，光鏡觀察肝臟組織病理變化，主要觀察點(diǎn)包括是否有脂肪變性、纖維化及炎癥。

1.3.5 肝臟PTP1B、IRS-2 mRNA檢測 總RNA提取：根據(jù)Trizol試劑的說明進(jìn)行操作，采用異硫氰酸胍一步法。用1%的瓊脂糖凝膠電泳確定所提總RNA的完整性，所提RNA的含量和純度采用紫外分光光度計(jì)檢測。cDNA合成：模板是分別取3 μg總RNA，再加入Oligo（dT）和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶后，cDNA第一鏈?zhǔn)且?5 μL體系在42℃下反應(yīng)1 h合成的，之后加熱3 min，溫度為94℃來滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增：采用SYBR GreenⅠ熒光染料技術(shù)，在20 μL反應(yīng)體系中，加入ddH2O 3 μL、cDNA 6 μL、SYBR Green熒光定量PCR Mix 10 μL、引物1 μL（PTP1B上游引物：5′-TGGCTGTGATCGAGGGTG-3′，下游引物：5′-TGAGGCTCCAATGTGCGTTTGGGTG-3′；IRS-2上游引物：5′-TGCCAACACCCGTCGCTGAC-3′，下游引物：5′-CACCGGTGACGGGTGAACGG-3′）。在CFX-96系統(tǒng)上進(jìn)行PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)采集，記錄其循環(huán)閾值（Ct），每個(gè)樣品中靶基因的相對mRNA表達(dá)采用相對定量公式2-ΔΔCt計(jì)算，其中ΔCt值=靶基因Ct值-β-actin Ct值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采SPSS 17.0軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

與正常組大鼠比較，模型組大鼠的精神狀態(tài)萎靡，懶于運(yùn)動，性情不活潑，皮毛凌亂且無光澤。吡格列酮組、姜黃素組相較于正常組大鼠也有不同程度的飲食和活動減少，皮毛欠光澤。

2.2 大鼠體重、肝臟指數(shù)的變化

高脂喂養(yǎng)前，正常組與高脂組體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），高脂飲食喂養(yǎng)8周后（STZ造模前），與正常組比較，高脂組大鼠體重明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。造模后，模型組和姜黃素組、吡格列酮組體重較正常組明顯增加（P < 0.05）；造模2、8周后，姜黃素組大鼠體重比同期模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），吡格列酮組大鼠體重和同期模型組比較差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。與正常組比較，模型組肝重和肝臟指數(shù)明顯升高（P < 0.05）；與模型組比較，姜黃素組、吡格列酮組肝重和肝臟指數(shù)則明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.3 大鼠血脂、FBG、FINS、ISI的變化

模型組、姜黃素組、吡格列酮組TC、TG、LDL-C、HDL-C各項(xiàng)指標(biāo)均較正常組明顯升高（P < 0.05）。姜黃素組、吡格列酮組LDL-C較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。造模4、8周后，模型組FBG、FINS較正常組明顯升高，ISI較正常組明顯降低（P < 0.05）；姜黃素組、吡格列酮組大鼠FBG較同期模型組明顯下降（P < 0.05），但用藥8周后吡格列酮組大鼠的FBG有所回升；與同期模型組比較，姜黃素組、吡格列酮組大鼠FINS顯著降低，ISI顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表4。

2.4 肝臟病理學(xué)觀察

2.4.1 解剖觀察 正常組大鼠的肝臟邊緣清晰，顏色鮮紅，表面光滑，質(zhì)地有彈性。模型組大鼠的肝臟色土黃，邊緣比較鈍且質(zhì)地柔軟，體積明顯增大，切面呈現(xiàn)明顯油膩感，表現(xiàn)為典型的脂肪肝外觀。吡格列酮組和姜黃素組的部分肝臟外觀接近正常組，但是肝臟顏色還是淺黃，體積有所增大，表面仍有油膩感，但是較之模型組有所減輕。

2.4.2 光鏡觀察 與正常組大鼠比較，模型組大鼠肝臟的肝細(xì)胞呈現(xiàn)重度脂肪變性：肝細(xì)胞漿內(nèi)充斥著大小不等的脂肪空炮，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)整個(gè)細(xì)胞大空泡樣即胞核消失，整個(gè)肝細(xì)胞完全被脂肪充滿。部分出現(xiàn)輕微的纖維化改變：肝細(xì)胞呈現(xiàn)溶解壞死，細(xì)胞間有少量炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組比較，姜黃素組、吡格列酮組大鼠的肝臟病理均有不同程度的改善：病理呈現(xiàn)的脂肪變性主要為輕中度，脂肪變肝細(xì)胞數(shù)目減少，肝細(xì)胞多為正常形態(tài)，胞漿豐富，內(nèi)脂滴減少或者消失，基本沒有或者僅見少量炎癥細(xì)胞浸潤，未見纖維改變。見圖1（封三）。

2.5 大鼠肝臟組織PTP1B、IRS-2 mRNA表達(dá)情況

正常組肝臟組織IRS-2 mRNA呈高水平表達(dá)，PTP1B mRNA呈低表達(dá)水平。與正常組比較，模型組肝臟組織IRS-2 mRNA表達(dá)降低，PTP1B mRNA表達(dá)升高（P < 0.05），姜黃素組和吡格列酮組IRS-2 mRNA表達(dá)亦明顯降低（P < 0.05）。與模型組比較，姜黃素組和吡格列酮組IRS-2 mRNA表達(dá)明顯增加，PTP1B mRNA表達(dá)明顯降低（P < 0.05）。見表5。

3 討論

肝臟出現(xiàn)胰島素抵抗時(shí)的主要表現(xiàn)是肝糖原合成減少，糖異生增加，從而導(dǎo)致整個(gè)糖代謝紊亂。肝臟作為胰島素作用的主要靶器官，其本身出現(xiàn)胰島素抵抗時(shí)，主要表現(xiàn)為胰島素與受體結(jié)合后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)引起的一系列代謝過程障礙。發(fā)生在IRS蛋白分子水平上的胰島素抵抗主要表現(xiàn)為通過降低IRS基因表達(dá)，減少蛋白量及功能障礙來影響胰島素信號的有效傳導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗。IRS-2主要表達(dá)在肝臟和胰島β細(xì)胞，小鼠敲除IRS-2基因后，則會發(fā)生外周胰島素抵抗以及代償性胰島素分泌不足，說明IRS-2蛋白是聯(lián)系外周胰島素抵抗和β細(xì)胞功能缺陷的重要介質(zhì)[3]。類固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）是IRS-2調(diào)控脂質(zhì)合成的重要樞紐，下調(diào)IRS-2可影響其下游PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而減少肝糖原的合成，增加脂肪的合成，這些現(xiàn)象均提示肝細(xì)胞肝臟胰島素抵抗與肝細(xì)胞的脂肪變性呈現(xiàn)高度相關(guān)性[4]。小鼠敲除PTP1B基因后會免遭飲食誘導(dǎo)的肥胖，考慮與增加了基礎(chǔ)代謝率和總能量消耗有關(guān)，表明缺乏PTP1B基因的小鼠的胰島素敏感性明顯增加，肝臟、肌肉中的胰島素受體磷酸化水平增強(qiáng)，這提示PTP1B是體內(nèi)能量平衡、胰島素敏感性和體脂貯存的重要調(diào)節(jié)因素[5]。

課題組在臨床研究中發(fā)現(xiàn)具有情志問題病史是很多糖尿病患者的共性[6-7]，這恰恰與中醫(yī)的病先傷于肝者、多為情志所傷的理論契合。情郁、氣怒多傷肝，肝傷則失疏泄，疏泄失司，則氣血失運(yùn)，五臟氣機(jī)升降出入皆紊亂，整個(gè)機(jī)體新陳代謝的動態(tài)變化失衡。故而運(yùn)化失常，導(dǎo)致水谷精微輸布障礙而蓄積于體內(nèi)，終化為濕、痰、濁，久則郁熱、濕滯、血瘀等相互搏結(jié)，則出現(xiàn)高血糖、高血脂等一系列糖、脂代謝異常。課題組經(jīng)過多年臨床實(shí)踐，根據(jù)這一系列病理變化而針對性地采取疏肝行氣為主、健脾益腎為輔的治則，以郁金、姜黃為主藥。而郁金、姜黃的主要活性成分是姜黃素，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有降血脂、防治糖尿病等多種作用[8]。本研究結(jié)果進(jìn)一步提示，姜黃素可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠的體重、血糖、空腹FINS，增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗；同時(shí)可以降低血脂（主要是LDL-C）、肝臟指數(shù)，改善脂質(zhì)代謝及肝臟脂肪變性。在印證糖尿病從肝論治的中醫(yī)理論的基礎(chǔ)上，提示其分子機(jī)制可能與抑制PTP1B mRNA表達(dá)從而上調(diào)IRS-2 mRNA表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2018-04-23 本文編輯：張瑜杰）