李 珂

呼吸道合胞病毒是引發(fā)全球范圍內(nèi)小兒急性下呼吸道感染的主要病原體，毛細(xì)支氣管炎和肺炎等是由其引發(fā)的常見疾病類型，診治不及時(shí)將引發(fā)呼吸衰竭甚至死亡，有數(shù)據(jù)報(bào)告顯示全球每年有7～20 萬例5 歲以下兒童死于急性下呼吸道感染，帶給家庭及社會沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。呼吸道合胞病毒主要侵襲患兒呼吸道，誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及趨化因子等炎癥因子，引發(fā)器官以及支氣管痙攣等氣道高反應(yīng)性，從而危害嬰幼兒生命健康[2]。Toll 樣受體（TLRs）是連接天然免疫以及獲得性免疫的模式識別受體，能特異性地識別來源于特定類型微生物中保守結(jié)構(gòu)的分子，通過對細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑進(jìn)行激活，從而激活固有免疫反應(yīng)，在機(jī)體建立特異性免疫中發(fā)揮重要作用[3]。有文獻(xiàn)報(bào)告指出TLRs 在代謝綜合征患者、慢性乙型肝炎患者中發(fā)揮重要作用[4]，國外學(xué)者研究則表明TLRs 及其信號通路在宿主感染呼吸道合胞病毒后發(fā)揮著重要作用[5]，本研究旨在探討呼吸道合胞病毒感染患兒外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）上TLRs 的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料 以2016年3月～2018年3月我院收治的65例呼吸道合胞病毒感染患兒（記為觀察組）和同期在我院體檢的35例健康兒童（記為健康組）為研究對象，患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：①患兒入院后經(jīng)呼吸道分泌物檢測提示呼吸道合胞病毒抗原陽性；②年齡≤12 歲；③未合并先天性心臟病、免疫缺陷及支氣管發(fā)育不良等疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有細(xì)菌或衣原體等其他病原體感染者。健康兒童納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤12 歲；②既往無呼吸道合胞病毒感染史；③既往無細(xì)菌或衣原體等病原體感染史。觀察組65例，男36例，女29例，年齡4～12 歲，平均（7.26±2.03）歲；健康組35例，男19例，女16例，年齡4～11 歲，平均（8.01±2.01）歲。兩組性別、年齡基線資料相比較無明顯差異（P＞0.05），有可比性。

1.2 研究方法 ①臨床資料收集：采用我院自制調(diào)查問卷對納入研究對象的臨床資料進(jìn)行調(diào)查，主要調(diào)查納入對象性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、炎癥因子[白介素-6（IL-6）、白介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），采用放射免疫分析法檢測IL-6、IL-17；雙抗體夾心法檢測TNF-α 水平，試劑由福建邁特生物工程有限公司提供]水平。②外周血單個核細(xì)胞制備：采集納入研究對象外周血，采用肝素抗凝，密度梯度進(jìn)行離心以獲得PBMCs，將其懸浮于1640 培養(yǎng)基(由10%的胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml、L-谷氨酰胺1.5mM組成)，最后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，采用臺盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞存活狀態(tài)(＞98%)。③外周血單個核細(xì)胞中TLRs 檢測，外周全血肝素抗凝，紅細(xì)胞裂解液加入，10min 后離心，1ml PBS 液重復(fù)洗滌細(xì)胞兩次，每管加入20μl PE 標(biāo)記的鼠抗人TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 單抗(由北京中山生物公司提供)，混勻后室溫遮光孵育0.5h，PBS 洗滌液洗滌一次后，將熒光染色的細(xì)胞離心沉淀，每只管內(nèi)加入多聚甲醛固定10min 后，將其放在4℃處保存待用，離心后將上清液去掉，采用PBS 液對細(xì)胞密度進(jìn)行調(diào)整，最終調(diào)整為2×109/L；采用 TR Lzol 法提取細(xì)胞總RNA，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，適當(dāng)比例稀釋后，行熒光定量PCR 擴(kuò)增，內(nèi)參物為GAPDH，反應(yīng)條件:95℃各10min、15s，55 ℃1min，72 ℃10s，共重復(fù)38個循環(huán)；TLR 相對表達(dá)量以TLR 與內(nèi)參物GAPDH 表達(dá)量的比值進(jìn)行表示；每個樣本設(shè)3 個重復(fù)孔，取平均值，引物（上海生工合成）序列：TLR-3上游引物5'-GCCTCTCCAAGGAAGAATCC-3'，下游引物5'-TCCTGTTGTTGGACAGGTCA-3'；TLR-4 上游引物5'-AATCTAGAGCACTTGGACCTTTCC-3'，下游引物5'-GGGTTCAGGGACAGGTCTAAAGA-3'；TLR-7上游引物 5'-AAGAAAGGTTCCCGCAGACTT-3'，下游引物5'-TGTTATGGCATAGAATCAAAACTCTCA-3'；TLR-9 上游引物 5'-GGACCTCT-GGTACTGCTTCCA-3'，下游引物5'-AAGCTCGTT-GTACACCCAGTCT-3'；GAPDH上游引物5'-AGAAGGCTGGGCTCATTTG-3'，下游引物 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 軟件分析處理研究數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s 表示，組間對比行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間對比行χ2檢驗(yàn)，符合正太分布計(jì)量資料間行Pearson 相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)間回歸分析采用多元Logistic 回歸分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。均行雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組性別、年齡、BMI 相比無明顯差異（P＞0.05）；觀察組IL-6、IL-17、TNF-α較健康組明顯高，差異顯著（P＜0.05），見表1。

2.2 兩組PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 的表達(dá)水平 觀察組PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 表達(dá)水平較健康組明顯高，差異顯著（P＜0.05），見表2。

2.3 觀 察 組TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 與 臨 床指標(biāo)的相關(guān)性分析 以呼吸道合胞病毒感染患兒PBMCs TLRs 為應(yīng)變量，以年齡、性別、BMI、IL-6、IL-17、TNF-α 等為自變量，進(jìn)行多元逐步回歸分析，IL-6、IL-17、TNF-α 代入回歸方程（P＜0.05），常數(shù)項(xiàng)為0。相關(guān)性分析提示呼吸道合胞病毒感染患兒IL-6、IL-17、TNF-α 水平與TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 表達(dá)水平均呈明顯正相關(guān)（P＜0.05），而患者性別、年齡、BMI 與TLR3、TLR4、TLR7、TLR9無明顯相關(guān)性（P＞0.05），見表3。

表1 兩組臨床資料比較（±s）

項(xiàng)目 + 觀察組（n=65）健康組（n=35） t/χ2 P性別（男/女） 36/29 19/16 0.011 0.916年齡（歲） 7.26±2.03 8.01±2.01 1.768 0.080 BMI（kg/m2） 16.98±3.05 17.01±3.08 0.047 0.963 IL-6（ng/L） 315.26±24.14 102.31±32.87 36.955 0.000 IL-17（ng/ml） 321.62±31.13 192.58±19.18 22.319 0.000 TNF-α（ng/L） 25.16±6.12 2.87±1.01 21.343 0.000

表2 兩組PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 的表達(dá)水平（±s）

表2 兩組PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 的表達(dá)水平（±s）

組別 TLR3 TLR4 TLR7 TLR9觀察組（n=65）0.13±0.04 0.14±0.05 0.15±0.05 0.16±0.06健康組（n=35）0.07±0.02 0.08±0.02 0.07±0.03 0.08±0.03 t 8.318 6.800 8.652 7.394 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 觀察組TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

呼吸道合胞病毒是有胞膜非片段的單股負(fù)鏈RNA 病毒，常侵襲兒童的呼吸道，其發(fā)病機(jī)制為呼吸道合胞病毒通過誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子以及趨化因子等炎癥因子，引發(fā)氣管以及支氣管痙攣?zhàn)罱K導(dǎo)致氣道高反應(yīng)，呼吸道合胞病毒是目前引發(fā)嬰幼兒下呼吸道感染的常見病原體[6]；而TLRs 是目前臨床中用以連接天然免疫及獲得性免疫的模式識別受體，其可激活細(xì)胞信號通路途徑和機(jī)體固有免疫反應(yīng)[7]，有研究指出TLRs 在宿主感染呼吸道合胞病毒中發(fā)揮重要作用[8]，臨床積極探究呼吸道合胞病毒感染患兒PBMCs TLRs 的表達(dá)及意義，為防治兒童呼吸道合胞病毒感染性疾病提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：觀察組IL-6、IL-17、TNF-α 較健康組明顯高，觀察組PBMCs TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 表達(dá)水平較健康組明顯高，相關(guān)性分析提示呼吸道合胞病毒感染患兒IL-6、IL-17、TNF-α 水平與TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 表達(dá)水平均呈明顯正相關(guān)，IL-6、IL-17、TNF-α、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 在呼吸道合胞病毒感染患兒中發(fā)揮著重要作用。

TLRs 為Ⅰ型跨膜受體蛋白，主要包含胞外區(qū)、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)組成，而TLRs 的胞內(nèi)區(qū)與IL-1R 家族各成員胞內(nèi)區(qū)同源，有200 多個氨基酸組成，稱為Toll/IL-1 受體結(jié)構(gòu)域（TIR 結(jié)構(gòu)域），TIR有嗜同性相互作用，是TLRs 向下游進(jìn)行信號傳遞的樞紐[9]；本研究結(jié)果提示呼吸道合胞病毒感染患兒炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α 與TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 呈明顯正相關(guān)，表明TLRs 在呼吸道合胞病毒感染患兒中發(fā)揮重要作用，呼吸道合胞病毒感染在轉(zhuǎn)錄及翻譯過程中可產(chǎn)生大量的雙鏈RNA，可特異性地被TLR3 識別，早期文獻(xiàn)報(bào)道指出通過TLR3 激活的嗜酸性粒細(xì)胞可募集白細(xì)胞聚集于炎癥部位，此外TLR3 在過敏性鼻炎以及過敏性氣道炎癥中呈弱表達(dá)，可推斷TLRs 在呼吸道合胞病毒感染中發(fā)揮重要作用[10]。呼吸道合胞病毒感染可引發(fā)TLR4 表達(dá)量明顯升高，在增強(qiáng)呼吸道上皮細(xì)胞對脂多糖的敏感性中發(fā)揮重要作用，機(jī)體上皮細(xì)胞感染呼吸道合胞病毒后，TLR4 的信使RNA 及蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，與之相關(guān)的炎癥因子水平也隨之明顯升高，早期研究也證實(shí)TLR4 及其信號通路可能參與了呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞急、慢性炎癥反應(yīng)[11]。TLR7 對感染呼吸道合胞病毒后的免疫效應(yīng)與TLR3 是類似的，兩者都可上調(diào)信使RNA及其蛋白表達(dá)，既往動物實(shí)驗(yàn)研究也表明TLR7 作用的小鼠其炎癥因子IL-23 和IL-12 水平明顯升高[12]，這也證實(shí)了TLR7 在呼吸道合胞病毒感染疾病發(fā)生中有重要作用。而TLR9 同樣參與了呼吸道合胞病毒感染過程中，其可上調(diào)感染呼吸道合胞病毒者TNF-α 水平，引發(fā)炎癥性疾病，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符[13]。由本次研究結(jié)果我們可推測TLRs 在啟動宿主細(xì)胞對病毒的固有免疫、調(diào)節(jié)機(jī)體建立特異性免疫中作用顯著，機(jī)體感染呼吸道合胞病毒可與不同TLRs 特異性結(jié)合，誘導(dǎo)下游炎癥因子等的分泌，引發(fā)炎癥性疾病[14]。

綜上所述，PBMCs TLRs 的表達(dá)在呼吸道合胞病毒感染性疾病中發(fā)揮重要作用，為呼吸道合胞病毒感染患兒新型治療藥物的開發(fā)提供參考信息。