張旭林，徐永清，毛羽馳,何曉清，劉 帥

作者單位：650032昆明，昆明醫(yī)科大學(xué)研究生部（張旭林，毛羽馳，劉 帥）；解放軍920醫(yī)院骨科（張旭林，徐永清，何曉清，劉 帥）

在骨科臨床實踐中，伊利扎諾夫技術(shù)（Ilizarov）解決了許多令醫(yī)生們頭疼的疑難雜癥，其治療適應(yīng)證也在基礎(chǔ)研究的帶領(lǐng)下不斷拓寬，如糖尿病足、腦中風(fēng)、脊柱側(cè)彎等。而該技術(shù)的核心“張力-應(yīng)力法則”，則進(jìn)一步將應(yīng)力與細(xì)胞分化聯(lián)系在一起。但該技術(shù)目前最大的阻礙是長時間佩戴給患者帶來的不便及引起的各種臨床并發(fā)癥[1]。隨著伊利扎諾夫技術(shù)的推廣，尋求縮短治療時間和減少并發(fā)癥的方法顯得極為重要。而三維細(xì)胞培養(yǎng)可能是解決上述問題的有效措施的基礎(chǔ)之一，因此，筆者對三維培養(yǎng)下應(yīng)力對間充質(zhì)干細(xì)胞分化的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 三維培養(yǎng)對應(yīng)力下間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化研究的優(yōu)勢

MSCs是一種具有多向分化潛能，來源于中胚層和神經(jīng)外胚層，并且不表達(dá)造血系相關(guān)標(biāo)志的成體多能干細(xì)胞[2]。根據(jù)來源可以分為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞等。目前相關(guān)文獻(xiàn)均認(rèn)為身體的各部分間充質(zhì)內(nèi)均含有MSCs，而且其比成體干細(xì)胞有更大的分化潛能，同時也減少了倫理審查的要求，所以，MSCs從發(fā)現(xiàn)之初便被寄予厚望[3-4]。但在諸如實驗室普通細(xì)胞瓶等二維培養(yǎng)環(huán)境下，MSCs分化率低。而立體培養(yǎng)技術(shù)相對而言，更能模擬身體內(nèi)細(xì)胞的生理環(huán)境，有利于細(xì)胞的基因表達(dá)和信號傳導(dǎo)，更有利于模擬牽拉成骨過程中應(yīng)力對MSCs分化的影響，進(jìn)而研究提高牽拉成骨效率的方法。

1.1 三維培養(yǎng)下細(xì)胞聯(lián)系密切 二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是近代生物醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)，但是，以這種模式所建立的細(xì)胞模型與細(xì)胞實際所處的生長環(huán)境有差異，不能像體內(nèi)一樣進(jìn)行信號通路和內(nèi)分泌傳導(dǎo)。而三維培養(yǎng)作為一種更接近于機體生理環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)方式，它更能給細(xì)胞提供生長和信息傳遞所需的仿生環(huán)境?；诖颂攸c，在腫瘤、干細(xì)胞、組織工程等領(lǐng)域中，三維細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用價值更為突出。Hanahan等[5]研究表明，三維培養(yǎng)下更能觀察到腫瘤獨特的性質(zhì)，包括獨特的生長信號、永生性、無限復(fù)制、失控的血管增殖、組織侵襲、躲避免疫攻擊、促進(jìn)腫瘤的炎癥等特性。所以，不斷有研究者利用三維培養(yǎng)來論證其優(yōu)勢。Wang等[6]用三維培養(yǎng)來研究前列腺癌，證實了細(xì)胞與三維支架所形成的結(jié)構(gòu)對細(xì)胞的分化和表型均有幫助；Kim等[7]通過乳腺癌細(xì)胞實驗表明，三維細(xì)胞培養(yǎng)可以實現(xiàn)在同一體系中培養(yǎng)不同表型的腫瘤細(xì)胞，比傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)更準(zhǔn)確地模擬腫瘤組織的結(jié)構(gòu)和分化。

三維細(xì)胞培養(yǎng)類型根據(jù)外力施加的有無分為靜止三維培養(yǎng)和動力三維培養(yǎng)，其中由于靜止三維培養(yǎng)過程中重力是唯一的力學(xué)影響因素，而本綜述涉及的是外界應(yīng)力，所以，本研究只討論動力三維培養(yǎng)。在胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞間不僅通過自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)增殖和分化，也通過應(yīng)力的變化產(chǎn)生聯(lián)系。臨床應(yīng)用中Ilizarov技術(shù)就是一個很好的例子，通過緩慢牽拉組織來使某些組織獲得再生。Leucht等[8]的研究表明，應(yīng)力通過細(xì)胞外基質(zhì)傳遞到細(xì)胞，而應(yīng)力對細(xì)胞的刺激可以改變細(xì)胞內(nèi)部應(yīng)力的分布，使細(xì)胞發(fā)生變形，通過細(xì)胞膜上信號受體與周圍細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系。中外學(xué)者針對應(yīng)力對細(xì)胞內(nèi)部的影響做了很多研究，戚孟春等[9]對MSCs施加高應(yīng)力，然后觀察到細(xì)胞骨架F-actin（細(xì)胞框架的主要成分）解聚和重排的現(xiàn)象，不僅說明了高應(yīng)力對細(xì)胞骨架的破壞，而且說明細(xì)胞骨架是應(yīng)力的傳導(dǎo)途徑。此外，在細(xì)胞應(yīng)力與細(xì)胞內(nèi)聯(lián)系的研究中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)整合素、第二信使系統(tǒng)、應(yīng)力反應(yīng)原件（一種受應(yīng)力影響的順式調(diào)控原件）都是應(yīng)力與細(xì)胞溝通的重要組成部分[10-12]。而在這個連接通路上，細(xì)胞外基質(zhì)、整合素和細(xì)胞骨架所構(gòu)成的系統(tǒng)把應(yīng)力從力學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)信號起了極其重要的作用。而陳晨等[13]認(rèn)為，局部黏附蛋白也參與構(gòu)建了這個系統(tǒng)。而三維培養(yǎng)在生物支架的幫助下，可以使細(xì)胞間形成上述的“應(yīng)力傳遞系統(tǒng)”。

1.2 三維培養(yǎng)下細(xì)胞所受應(yīng)力 目前，三維細(xì)胞培養(yǎng)使用的方法有：細(xì)胞團培養(yǎng)、基質(zhì)覆蓋培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)等[14]，這幾種方法給細(xì)胞所提供的力學(xué)因素有利于促進(jìn)其增殖分化和形成外基質(zhì)。能對細(xì)胞產(chǎn)生影響的應(yīng)力目前主要包括微重力、剪切力、張力和壓力，在MSCs分化方面，流體靜壓也可以促進(jìn)其向軟骨分化。三維培養(yǎng)中能穩(wěn)定提供的是微重力（旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器可以模擬微重力失重狀態(tài)）和剪切力，而提供的流體剪切力不僅不會引起細(xì)胞破損，而且還有利于細(xì)胞成骨化[15]。但由于這些培養(yǎng)系統(tǒng)所產(chǎn)生的應(yīng)力不能方便廉價的提供張力和壓力，使外界牽拉力很難應(yīng)用與細(xì)胞培養(yǎng)中。水凝膠基質(zhì)材料常規(guī)都是單純的彈性材料，不能施加應(yīng)力，但哈佛的Ovijit等改良了普通的三維水凝膠培養(yǎng)法，其制作的有快速應(yīng)力松弛性質(zhì)的水凝膠能夠產(chǎn)生的彈性模量為17 kPa，能夠誘導(dǎo)MSCs形成天然骨基質(zhì)。這種方法不僅簡化了額外應(yīng)力的供應(yīng)，而且還促進(jìn)MSCs增殖分化[16]，最重要的是水凝膠本來就是三維培養(yǎng)中的骨架材料。

2 應(yīng)力對MSCs分化的影響

生理狀態(tài)下，受機體運動及重力的影響，體內(nèi)細(xì)胞的行為與張力、壓力、剪切力、重力等應(yīng)力有著密切的關(guān)系，這些應(yīng)力可能會對機體的生長發(fā)育產(chǎn)生重要的影響。

2.1 應(yīng)力大小與細(xì)胞分化 在體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，外界應(yīng)力刺激，會對細(xì)胞生長產(chǎn)生影響。劉天一等[17]通過用每天2次、每次0.5 h的離心力來處理骨髓MSCs，經(jīng)1～2個月后觀察發(fā)現(xiàn)，使用應(yīng)力的實驗組產(chǎn)生了更多的蛋白聚糖，說明MSCs在足夠應(yīng)力的刺激下產(chǎn)生了分化。Chaudhuri等[16]通過控制藻酸鹽水凝膠的納米級結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)水凝膠的的應(yīng)力松弛性能，從而模擬活組織的粘彈行為來進(jìn)行間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，實驗發(fā)現(xiàn)不同的彈性模量會影響干細(xì)胞分化的方向，當(dāng)彈性模量在10 kPa以內(nèi)時，其主要向脂肪細(xì)胞分化；而彈性模量升高到11～30 kPa時，其會向成骨細(xì)胞分化；同時在9 kPa和17 kPa時，向脂肪細(xì)胞分化的能力降低甚至不分化。Li等[18]通過先使用軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基來對大鼠的MSCs進(jìn)行前期培養(yǎng)，再對其施加液態(tài)靜壓力和大小為13～36 kPa、頻率為0.25 Hz的動態(tài)液體壓，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原纖維α1和聚集蛋白聚糖的基因表達(dá)增加，同時硫酸化糖胺聚糖發(fā)生富集，說明在應(yīng)力的作用下，細(xì)胞產(chǎn)生了相應(yīng)的應(yīng)答，趨向于軟骨分化。

2.2 應(yīng)力類型與細(xì)胞分化 在應(yīng)力（張力、剪切力、滲透壓及微重力）的來源中，滲透壓所產(chǎn)生的應(yīng)力是一個特殊的類型。在機體生理條件下，關(guān)節(jié)軟骨受到的滲透壓為350～450 mOsm。Caron等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)，可以通過提高軟骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基的滲透壓來增加MSCs Sox9、Col2α1、aggreca基因的表達(dá)。Lu等[20]通過對MSCs施加可調(diào)控的流體剪切力，發(fā)現(xiàn)不同的剪切力會影響MSCs向成骨或軟骨細(xì)胞的分化。Alves等[21]用三維培養(yǎng)模式動態(tài)灌注的方法，模仿生理條件下關(guān)節(jié)所受的剪切力，作者將MSCs接種于纖維支架上，實驗組放于灌注式生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)。實驗結(jié)果顯示含剪切力的實驗組MSCs發(fā)生了分化?；艚ㄖ业萚22]應(yīng)用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)以20 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)兔MSCs，發(fā)現(xiàn)三維應(yīng)力組的軟骨特異性基質(zhì)和Ⅱ型膠原酶的mRNA的表達(dá)明顯高于對照組。上述研究表明，應(yīng)力（張力、剪切力、滲透壓及微重力）對MSCs的生長、增殖及分化會產(chǎn)生重要的影響，尤其是在三維培養(yǎng)下，細(xì)胞應(yīng)力的傳遞系統(tǒng)更完整，對MSCs分化的促進(jìn)作用更明顯，但應(yīng)力對MSCs分化方向的影響機制尚未研究清楚。

3 未來與展望

目前，以牽拉成骨為代表的Ilizarov技術(shù)以其神奇的功效，不斷拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。但治療周期長、釘?shù)栏腥尽⑼夤潭苷{(diào)整、影響生活等問題難以解決。對于這些問題，不斷有學(xué)者探索解決的方法，倪明等[23]通過在牽拉成骨動物模型中注入富血小板血漿及脫鈣骨基質(zhì)，探索采用外界干預(yù)來縮短牽拉成骨時間的方法。對這類問題的探究或許可以改變很多疑難雜癥的治療方案。而三維培養(yǎng)下研究應(yīng)力與MSCs分化的關(guān)系，可以為解決這類問題提供基礎(chǔ)。