楊 驍，李夢俠（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院腫瘤中心，重慶400072）

腫瘤因發(fā)病率逐年提高，已成為危害人類健康的主要因素，而晚期腫瘤治療療效有限，是目前腫瘤研究領(lǐng)域的重要課題。盡管隨著基因檢測技術(shù)的普及和靶向藥物的問世，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)給腫瘤的治療帶來了曙光，但分子靶向治療僅適用于部分經(jīng)過選擇的腫瘤患者。因此，目前大多數(shù)晚期惡性腫瘤的治療仍然是基于傳統(tǒng)放化療的綜合治療模式。然而，最初對于放化療有效的腫瘤細(xì)胞最終會因治療抵抗而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，這是腫瘤治療的瓶頸和難點(diǎn)。DNA損傷是放化療致傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制，而腫瘤細(xì)胞中有完善的DNA修復(fù)機(jī)制，可以快速修復(fù)放化療所致的DNA損傷，產(chǎn)生放化療抵抗。因此，DNA修復(fù)基因作為抗腫瘤的新靶點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)。2017年7月，課題組與意大利的TELL及PIAZZA課題組在自然通訊上聯(lián)合發(fā)表的“Mammalian APE1 controls miRNA processing and its interactome is linked to cancer RNA metabolism”一文，對脫嘧啶核酸內(nèi)切酶（APE1）參與miRNA剪切成熟過程調(diào)控基因表達(dá)的相關(guān)機(jī)制做了詳細(xì)的闡述[1]。

1 研究背景

腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥與miRNA的關(guān)系，以及DNA修復(fù)與miRNA代謝的關(guān)系。APE1是多種抗腫瘤治療抵抗的重要基因，但是其關(guān)鍵的作用機(jī)制仍不明確。APE1具有AP核酸內(nèi)切酶活性，為負(fù)責(zé)修復(fù)DNA堿基簡單氧化和烷化性損傷的DNA堿基切除修復(fù)（BER）途徑主要限速酶之一，同時，APE1還可影響多種腫瘤細(xì)胞耐藥關(guān)鍵基因的表達(dá)。越來越多的研究表明，APE1是連接DNA BER、轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原調(diào)控和氧化應(yīng)激等重要生物學(xué)效應(yīng)的橋梁，對于細(xì)胞的存活至關(guān)重要[2-3]。課題組前期大量研究發(fā)現(xiàn)，APE1在多種惡性腫瘤中表達(dá)水平明顯升高，高表達(dá)率為72%～90%，且與晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）化療后預(yù)后不良呈顯著正相關(guān)[2]。更為重要的是，腫瘤高表達(dá)的APE1與多種腫瘤耐藥相關(guān)，包括能產(chǎn)生DNA堿基損傷烷化劑和X射線形成的電離輻射，以及產(chǎn)生DNA鏈間交聯(lián)的鉑類、阻礙微管形成的紫杉類、形成DNA雙鏈斷裂的博來霉素和依托泊苷[4]，甚至包括作用于表皮生長因子受體（EGFR）突變體的吉非替尼等分子靶向藥物。前期研究發(fā)現(xiàn)，血清中的APE1可以反映部分腫瘤組織APE1的水平，并且可以作為預(yù)測NSCLC對含鉑雙藥化療反應(yīng)（客觀緩解率和無進(jìn)展生存時間）和總生存的生物標(biāo)記物[5]。這些證據(jù)強(qiáng)烈提示，APE1在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)可以顯著增加腫瘤對多種抗腫瘤治療的抵抗，但有趣的是，APE1經(jīng)典的DNA損傷修復(fù)無法完全解釋其中大多數(shù)藥物抵抗的機(jī)制（如EGFR-TKIs），推測APE1可能通過未知的分子機(jī)制參與了對抗腫瘤治療抵抗更為重要和普遍的調(diào)控機(jī)制——細(xì)胞凋亡抵抗。凋亡抵抗不僅是腫瘤發(fā)生中的重要特征，還是介導(dǎo)腫瘤治療抵抗最為重要和普遍的機(jī)制。目前，關(guān)于腫瘤細(xì)胞凋亡抵抗的機(jī)制尚不完全清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除了眾多凋亡相關(guān)基因外，miRNA在其中的重要作用也越來越受到重視。實(shí)際上，在細(xì)胞凋亡途徑中，凋亡基因與相關(guān)miRNA相互交織構(gòu)成了一個十分復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，理論上這些凋亡相關(guān)蛋白與miRNA除了網(wǎng)絡(luò)式相互調(diào)控作用外，還可能存在節(jié)點(diǎn)的直接作用，但國內(nèi)外卻鮮有報道。

直到最近，TELL課題組及其他一些課題組證實(shí)，APE1具有重要的RNA酶活性，但是目前并不清楚這一活性在什么生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。APE1是一個經(jīng)典的DNA結(jié)合蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)可以插入DNA雙螺旋的大溝并與AP位點(diǎn)結(jié)合。加拿大LEE課題組偶然發(fā)現(xiàn)，將APE1引入RNA世界，APE1能夠結(jié)合在cmyc的mRNA編碼區(qū)決定序列，并且優(yōu)先選擇在UA和CA區(qū)域之間剪切主鏈造成c-myc的mRNA的降解，首次揭示了APE1對RNA的降解作用[6]。該課題組進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，APE1可以剪切多種RNA，包括CD44的mRNA、miR-21、miR-10b和SARS病毒的RNA組分，這項(xiàng)研究提示APE1對RNA的作用具有序列非選擇性，但是在嘌呤堿基之后具有更強(qiáng)的切除作用[7]。隨后的研究在蛋白結(jié)構(gòu)和生化實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)了APE1對RNA具有非選擇性剪切作用，不依賴于AP位點(diǎn)，但是參與RNA剪切的蛋白活性區(qū)域與AP內(nèi)切酶相同，很可能是其參與RNA代謝的重要機(jī)制[8]。有研究發(fā)現(xiàn)其具體機(jī)構(gòu)包括：（1）APE1可以通過其N端結(jié)構(gòu)域的33個氨基酸殘基直接在體外結(jié)合具有特定結(jié)構(gòu)的RNA，包括一些primiRNA[9]；（2）APE1可以通過其內(nèi)切酶活性切開單鏈RNA上的缺堿基位點(diǎn)，參與RNA的降解[10]；（3）APE1具有3'-RNA磷酸酶和3'-核苷酸外切酶活性[8]；（4）APE1可以調(diào)控c-myc的mRNA水平及其在腫瘤細(xì)胞中的半衰期[6]。有趣的是，除了經(jīng)典的3'→5'-核苷酸外切酶，似乎沒有其他的酶可以識別并去除RNA分子中的缺堿基和氧化位點(diǎn)，也無法去除RNA分子中3'-末端的磷酸基團(tuán)，這也使得研究腫瘤細(xì)胞RNA代謝過程中APE1發(fā)揮的非典型活性變得十分重要[11]。同時，盡管這些研究都從生化角度證實(shí)了APE1是一個新型的RNA酶，并且對多種RNA底物有作用，但是目前仍然不明確APE1的RNA酶活性參與了哪些與RNA相關(guān)的細(xì)胞學(xué)過程，具有怎樣的生物學(xué)意義[12]。

2 APE1參與miRNA的剪切成熟，調(diào)控下游PTEN基因的表達(dá)

APE1能夠與部分pri-miRNA特異性結(jié)合，很可能是揭開APE1參與RNA代謝生物學(xué)意義的重要突破口，也有助于闡明APE1凋亡抵抗的新機(jī)制。有研究首次描繪了APE1通過miRNA剪切成熟參與基因表達(dá)調(diào)控的全景圖，發(fā)現(xiàn)在受到APE1穩(wěn)定敲低的HeLa細(xì)胞中受到影響最大的是一群與凋亡抵抗、和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的miRNA，這與APE1高表達(dá)細(xì)胞的惡性生物學(xué)表型，包括侵襲增殖能力增強(qiáng)及多種抗腫瘤細(xì)胞耐藥等非常吻合。有趣的是，TELL課題組在肝癌細(xì)胞株[13]、骨肉瘤細(xì)胞株中[14]發(fā)現(xiàn)了一些相似受到APE1調(diào)控的 miRNA，包括 miR-221、miR-10b、miR-484和miR-4443，與腫瘤對放化療的敏感性相關(guān)。我們通過RNA親和沉淀測序（RIP-seq）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，APE1與多個RNA序列有明確的、穩(wěn)定的結(jié)合，其中包括primiR-221和pri-miR-222。隨后，我們在多種腫瘤細(xì)胞株中證實(shí)了過表達(dá)APE1可以顯著增加與pri-miR-221和pri-miR-222結(jié)合作用。更為有趣的是，敲低APE1可以顯著增加HeLa細(xì)胞中pri-miR-221/222的表達(dá)，但是卻抑制了成熟的miR-221/222水平，這項(xiàng)結(jié)果提示，APE1與pri-miR-221/222的結(jié)合極有可能顯著促進(jìn)其成熟過程，從而阻遏下游靶基因介導(dǎo)的凋亡啟動。該結(jié)果首次確證了APE1可以與miRNA的前體穩(wěn)定結(jié)合，可能在miRNA加工成熟中具有重要的調(diào)控意義。

根據(jù)APE1的RNA酶活性特點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)APE1在部分miRNA剪切成熟過程中發(fā)揮了類似RNA酶Ⅲ的作用，促進(jìn)了miRNA的成熟。RNA酶Ⅲ是一類特異性識別雙鏈RNA的RNA酶，經(jīng)典的miRNA加工過程中主要是依靠2個RNA酶Ⅲ：DROSHA和DICER1。DROSHA主要是識別pri-miRNA上的莖環(huán)結(jié)構(gòu)與側(cè)翼的單鏈RNA交界部位，通過輔助的因子DGCR8/PASHA進(jìn)行剪切，形成pre-miRNA。而DICER1主要是識別pre-RNA的兩端，分別剪切環(huán)狀結(jié)構(gòu)和部分雙鏈RNA區(qū)域，形成配對的雙鏈miRNA。目前，有證據(jù)顯示，在多種腫瘤組織中都有全局性miRNA的下調(diào)，然而pri-miRNA卻多數(shù)呈高表達(dá)[15]，隨后的研究也證實(shí)，DROSHA和DICER1在多種腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)或者突變，被認(rèn)為是導(dǎo)致全局性miRNA下調(diào)的主要原因。值得關(guān)注的是，在存在DROSHA和DICER1介導(dǎo)的經(jīng)典miRNA成熟機(jī)制存在缺陷的腫瘤中，仍有小簇miRNA上調(diào)，其中包括很多具有抗凋亡、促增殖及促進(jìn)EMT功能的oncomiR。目前，對于這些miRNA上調(diào)的分子機(jī)制仍不清楚，推測可能與腫瘤中存在未知的miRNA加工成熟機(jī)制有關(guān)。前期研究顯示，APE1的RNA酶活性能夠行使剪切功能的區(qū)域主要位于單鏈RNA和非嚴(yán)格配對的雙鏈RNA[16]。前期發(fā)表在生化領(lǐng)域著名雜志Journal of Molecular Biology上研究顯示，APE1在DNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)與單鏈DNA的交界區(qū)域有顯著的活性[17]。鑒于miRNA前體剪切過程中形成與莖環(huán)狀DNA類似的結(jié)構(gòu)，我們推測APE1對于莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA也可能有活性。APE1與miR-221/222前體耦合的主要生物意義在于其快速發(fā)揮RNA酶活性促進(jìn)miR-221/222的剪切和成熟。具體來說，我們發(fā)現(xiàn)APE1作用的位點(diǎn)在：（1）pri-miRNA單鏈側(cè)翼區(qū)發(fā)揮類似于DROSHA酶的剪切作用；（2）pre-miRNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)的末端發(fā)揮類似于DICER1酶的剪切作用。另外，我們發(fā)現(xiàn)敲低APE1可以顯著增強(qiáng)miR-221/222靶基因抑癌基因PTEN的表達(dá)，降低磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的水平，這一結(jié)論在多種腫瘤的臨床樣本庫中得到了驗(yàn)證。

3 研究的臨床意義及科學(xué)價值

腫瘤是目前影響人類健康最重要的惡性疾病，其發(fā)病率和病死率都高居榜首。盡管目前大量的新藥，包括分子靶向藥物正在加速進(jìn)入臨床，但是耐藥仍是阻礙腫瘤患者治療療效的最大難題。令人遺憾的是，在腫瘤領(lǐng)域?qū)PE1參與耐藥的機(jī)制，特別是其影響的miRNA及其進(jìn)一步調(diào)控的耐藥基因仍然不得而知，亟待深入研究。經(jīng)過前期大量的篩選和驗(yàn)證工作，目前已經(jīng)有針對APE1不同活性的小分子抑制劑，包括針對其DNA修復(fù)活性的CRT0044876、InhibitorⅢ等，以及針對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的小分子抑制劑E3330。參與本研究的3個課題組，在前期也針對其轉(zhuǎn)錄活性篩選出基于中藥天然產(chǎn)物庫的棉酚、依布硒、丹參酮ⅡA等，以及針對APE1與NPM1結(jié)合的小分子抑制劑。值得注意的是，目前美國印第安納大學(xué)的MARK KELLEY教授已經(jīng)將APE1的抑制劑E3330按照臨床藥物成藥性進(jìn)行優(yōu)化改構(gòu)（命名為APX3330），已經(jīng)在胰腺癌等癌種進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)。本研究通過探索APE1在特定的miRNA剪切成熟及代謝過程中的詳細(xì)分子機(jī)制，重點(diǎn)針對多種耐藥腫瘤細(xì)胞模型和耐藥臨床標(biāo)本隊(duì)列，研究APE1對miRNA的影響并調(diào)控下游靶基因表達(dá)的通路在多種抗腫瘤治療耐藥中的關(guān)鍵作用，聚焦APE1的RNA酶活性在體內(nèi)外實(shí)時監(jiān)測與APE1的小分子抑制劑，在腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)中的聯(lián)合策略研發(fā)。通過研究APE1參與凋亡抵抗的新機(jī)制，以期闡明其RNA酶活性的重要生物學(xué)意義，有助于闡明APE1參與miRNA剪切成熟的普遍規(guī)律，發(fā)現(xiàn)oncomiR加工成熟的新機(jī)制，同時為克服腫瘤的治療抵抗，提高臨床治療療效提供科學(xué)依據(jù)。

4 研究帶來的新問題和未來研究的方向

有研究表明，APE1在RNA代謝過程中的作用，不僅僅局限于調(diào)控miRNA的表達(dá)。通過RIP測序分析，超過1 000個轉(zhuǎn)錄因子可與APE1結(jié)合，涉及腫瘤進(jìn)展的RNA代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及DNA修復(fù)的整個過程。研究人員通過對APE1的相互作用組學(xué)進(jìn)行全景描述，發(fā)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞里與APE1相互作用的蛋白中有很多與miRNA剪切成熟相關(guān)的蛋白，包括 NPM1、NCL、THRAP3、hnRNPU、PRP19、SFPQ、p53[18]。因此，APE1如何參與miRNA的剪切成熟，是否依賴其他輔助因子仍然值得深入研究。

此外，令人感興趣的是，人群中存在7種天然APE1蛋白突變體，特別是D148E位點(diǎn)突變與NSCLC的發(fā)生及惡性程度相關(guān)[19]，很可能具有凋亡抵抗的作用。更令人驚訝的是，這些突變體的DNA修復(fù)活性均未受到影響[10]。而TELL課題組發(fā)現(xiàn)，D238G、R237C和L104R這3種罕見的APE1突變體可以引起持續(xù)的應(yīng)激反應(yīng)，并影響腫瘤細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能是通過改變APE1相互作用組[20]和顯著降低其3'-RNA磷酸酶活性[21]。這些APE1的天然突變體是否能夠影響與RNA底物的結(jié)合能力，催化RNA剪切的活性，進(jìn)而發(fā)揮凋亡抵抗的效應(yīng)，均為研究者亟待解決的重要科學(xué)問題。

目前已開發(fā)的APE1檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附測定[22]、電化學(xué)免疫測定[23]、電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器法[24]、只能應(yīng)用于體外檢測，而且酶聯(lián)免疫法操作煩瑣、成本高，而電化學(xué)方法重復(fù)性差，且需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理，難以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中APE1的一步快速檢測。核酸熒光探針方法具備操作簡單、成本低、設(shè)計(jì)靈活、響應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于核酸酶的分析測定[25]。但由于核酸熒光探針易降解且很難進(jìn)入細(xì)胞，如何利用核酸探針實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)APE1活性的原位實(shí)時檢測是挑戰(zhàn)研究者的難題[26]。