崔鈺晗，宋 迪，劉 月，關宇鶴，陳蒙蒙，陳 凡，王 潔，楊 波

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

自噬主要是指細胞吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，通過溶酶體進行降解的過程。在生理情況下，自噬對于細胞存活、分化、發(fā)育以及穩(wěn)態(tài)的維持均至關重要。泛素化修飾在自噬調控方面起著重要作用。自噬的相關分子蛋白Unc-51樣自噬激活激酶1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)、自噬相關基因6同源物(autophagy related 6 homolog，ATG6)Beclin-1等存在泛素化修飾，因此，尋找其調控分子及泛素化修飾位點，對于探討自噬的發(fā)生機制具有重要意義。

1 自噬

自噬主要是通過細胞膜結構包裹部分細胞質和需要降解的受損細胞器、蛋白質等形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬-溶酶體，通過溶酶體內部的各種水解酶降解其所包裹的內容物，從而清除損傷的細胞器和錯誤折疊的蛋白質，降解產物作為細胞再生與修復的原料，以實現(xiàn)廢物利用[1]。自噬作為一種機體防御和應激的調節(jié)機制，參與一系列生理和病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，如果無適當?shù)恼{控，自噬會導致各種疾病，包括癌癥、自身免疫性疾病、炎癥性疾病以及神經退行性病變等[2]。根據細胞內成分進入溶酶體方式的不同，自噬主要分為3種類型：大自噬、小自噬和分子伴侶介導的自體吞噬[3]。大自噬所能降解的蛋白種類最為廣泛，本文介紹的自噬主要是指大自噬。

自噬的發(fā)生起始于自噬小體形成，自噬小體形成又依賴于一系列自噬相關蛋白(autophagy-related gene，ATG)的參與[4]。迄今為止，在酵母中已發(fā)現(xiàn)40余種ATG家族成員，大多數(shù)在人體內具有同源物[5]。然而，只有不到50%的ATG蛋白對于經典自噬小體的形成是必要的，包括ATG 1～10、12～14、16～18、29和31[6]。在經典的自噬信號通路中，有2種類泛素的結合系統(tǒng)：ATG12耦合系統(tǒng)和微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，MAP-LC3)/ATG8脂聯(lián)系統(tǒng)，這2套系統(tǒng)均需要同一個泛素激活酶E1 (ubiquitin-activating enzyme，E1)ATG7的參與[7]。在ATG12耦合系統(tǒng)中，ATG7促進ATG12-ATG5復合物的形成[8]；在LC3脂聯(lián)系統(tǒng)中，ATG7促進LC3-I形成LC3-磷脂酰乙醇胺復合物，也被稱為LC3-Ⅱ，是目前最廣泛使用的自噬標志物[9]。目前研究表明，細胞自噬在組織穩(wěn)態(tài)、人類疾病(如腫瘤、神經退行性病變、感染等)、免疫和衰老中發(fā)揮了舉足輕重的作用[10]。

2 泛素化修飾

76個氨基酸組成的泛素分子是具有高度保守性的小分子蛋白質，在真核生物細胞中分布廣泛。在酶的介導下，泛素分子與蛋白質結合，使靶蛋白被26S蛋白酶體識別并降解。泛素化是一個復雜的過程，作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾，泛素化修飾在多種酶的參與下完成。參與泛素化修飾的酶主要包括泛素激活酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3，其中，泛素激活酶E1和泛素結合酶E2特異性較差，靶蛋白的選擇主要是由泛素連接酶E3決定[11]。泛素化修飾主要分為3個步驟進行：第 1 步，在三磷腺苷水解提供能量的情況下，泛素激活酶E1與泛素分子C末端的半胱氨酸殘基結合，激活泛素分子；第2步，泛素激活酶E1將活化的泛素分子轉移到泛素結合酶E2上；第3步，泛素連接酶E3將泛素結合酶E2上的泛素分子轉移到靶蛋白上，完成泛素化修飾[12]。

泛素化修飾根據泛素分子的連接方式可以分為單泛素化修飾和多聚泛素化。只有1個泛素分子連接在靶蛋白的賴氨酸殘基上稱為單泛素化；而多個泛素分子結合形成鏈狀連接在靶蛋白的賴氨酸殘基上稱為多聚泛素化。目前，單泛素化修飾報道較少，關于泛素化修飾的研究主要集中在多聚泛素化修飾上，包括K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位連接修飾[13]，其中對K48和K63位多聚泛素化研究最為廣泛。K48位多聚泛素化修飾主要促進靶蛋白通過蛋白酶體發(fā)生降解，K63位多聚泛素化修飾則調節(jié)靶蛋白功能。泛素化修飾在許多生理功能中發(fā)揮作用，已經成為現(xiàn)階段新的研究熱點。

3 自噬過程中的泛素化修飾

近年來，有關ATG蛋白翻譯后修飾的研究越來越多，比較常見的包括磷酸化、糖基化、泛素化及乙?；萚14]，目前研究最多最為透徹的是磷酸化修飾。自噬關鍵分子ULK1、Beclin-1等存在泛素化修飾，并影響自噬的形成，提示泛素化修飾在自噬的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色。

3.1ULK1在酵母中，細胞自噬的形成需要多達40個分子的參與，而在哺乳動物細胞中需要更多。細胞自噬通過ULKl復合物得以啟動。ULK1是一個絲氨酸/蘇氨酸激酶，是重要的人類細胞自噬相關蛋白之一，位于人類12號染色體的q24.3。ULK1是由人ULK1基因編碼的酶，其在酵母中的同源分子是ATG1[15]。酵母中ULK復合物含有ATG1和ATG13等組分，而哺乳動物中的ULK復合物除了ULK1、ULK2和ATG13，還包含ATG101和局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)家族相互作用蛋白200(FAK-family interacting protein of 200，F(xiàn)IP200)等蛋白質[16]。哺乳動物基因組中ULK1同源家族成員很多，包括ULK1、ULK2、ULK3、ULK4和STK36[17]，這些蛋白都包含一個保守的N端結構域。目前已知ULKl和ULK2在細胞自噬中發(fā)揮重要作用，在小鼠胚胎成纖維細胞中同時敲除ULKl和ULK2可以顯著抑制依賴于營養(yǎng)的細胞自噬[18]。在ULK1復合物中，ULK1通過其C末端直接與FIP200結合，而ATG13則能夠增強ULK1和FIP200的結合[19]。FIP200與ATG13共同調節(jié)了ULK1在自噬過程中的激酶活性。ULK1-ATG13-FIP200復合物的形成不會因營養(yǎng)條件的變化而改變，而在營養(yǎng)富足狀態(tài)下，哺乳動物西羅莫司靶蛋白1與ULK1復合物相互作用，下調ULK1復合物的活性，自噬發(fā)生被抑制。西羅莫司誘導或者饑餓狀態(tài)下，哺乳動物西羅莫司靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex-1，mTORC1)與ULK1復合物解離，使ULK1的活性得以恢復，促進自噬形成[20]。

K63泛素鏈在自噬形成過程中具有重要作用。有研究表明，Beclin-1調控自噬激活分子(activating molecule in Beclin-1 regulated autophagy，AMBRA1)通過與腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumour necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)相互作用，促進ULK1的K63位連接的泛素化修飾，進而提高其穩(wěn)定性，促進自噬的發(fā)生[21]。TRAF6過表達后，發(fā)現(xiàn)本底和饑餓誘導條件下自噬形成增多；然而，將AMBRA1敲低以后，TRAF6過表達誘導自噬的能力有所降低，表明TRAF6誘導自噬可能依賴于AMBRA1[22]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6與AMBRA1和ULK1存在明顯的共定位，當下調AMBRA1表達時，TRAF6與ULK1相互作用的能力受到影響，說明AMBRA1對于TRAF6-ULK1的泛素化修飾在它們誘導自噬的過程中具有重要作用[23]。

LEE等[24]研究發(fā)現(xiàn)，Cul3-KLHL20泛素連接酶可以通過泛素化修飾促進ULK1降解來終結自噬的發(fā)生，而Kelch樣蛋白20(Kelch-like protein 20，KLHL20)基因敲除增加了ULK1的蛋白穩(wěn)定性。此外，在Roc1-Cul3-KLHL20復合物存在下，ULK1在體外系統(tǒng)中發(fā)生了泛素化修飾，這些結果提示，ULK1很可能是E3連接酶KLHL20的直接底物。KLHL20過度表達下調了ULK1的蛋白水平，并且，在KLHL20的Cul3結合缺陷型突變體中未觀察到這種現(xiàn)象，提示KLHL20功能的發(fā)揮依賴于和Cul3的結合。KLHL20誘導的ULK1表達下調可以被蛋白酶體抑制劑MG132恢復，說明KLHL20依賴性ULK1降解是通過蛋白酶體途徑的。ALEMU等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在饑餓環(huán)境下，ULK1蛋白水平逐漸下降，并且隨著饑餓時間的延長，ULK1 K48位泛素化修飾程度增加，這與LEE等[24]的研究相吻合。因此，KLHL20介導饑餓誘導的ULK1泛素化修飾和降解有助于自噬的終止[26]。

3.2Beclin-1Beclin-1是酵母中ATG6/空泡蛋白分選30(vacuolar protein-sorting 30，VPS30)的同源基因，是哺乳動物細胞參與自噬的關鍵節(jié)點分子。研究表明，Beclin-1不僅參與自噬體的形成，還能夠通過調節(jié)自噬活性參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[27]。在自噬發(fā)生過程中，自噬與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復制的調控密切相關。HBV X蛋白是HBV生物學過程中的一種多功能調節(jié)因子，其對HBV自噬誘導至關重要，HBV X蛋白通過上調Beclin-1蛋白表達而增加自噬體的形成[28]；神經元前體細胞表達發(fā)育下調4(neuronal precursor cell expressed developmentally downregulation 4，NEDD4)在病毒感染過程中發(fā)揮著重要的作用，NEDD4通過與Beclin-1相互作用來抑制結核分枝桿菌和李斯特菌的復制，從而促進自噬的發(fā)生[29]。另外，抗凋亡蛋白Bcl-2在酵母和哺乳動物細胞中通過抑制Beclin-1的功能而削弱饑餓誘導的自噬體的發(fā)生[30]。在自噬發(fā)生過程中，Beclin-1蛋白存在多種翻譯后修飾，包括泛素化修飾，但泛素化修飾精確調節(jié)Beclin-1的機制仍然報道不多。

鋅指蛋白216 (ring finger protein 216，RNF216)是一種泛素連接酶，能夠強烈抑制巨噬細胞中的自噬。RNF216能夠與Beclin-1相互作用，促進Beclin-1的K48位連接的泛素化修飾。在肺泡巨噬細胞中過表達RNF216可抑制自噬的發(fā)生，而敲低RNF216可顯著抑制這些結果[31]。泛素連接酶NEDD4能促進Beclin-1的賴氨酸第11位(lysine-11，K11)連接的泛素化修飾，影響B(tài)eclin-1的穩(wěn)定性。而VPS34敲除以后，NEDD4介導的Beclin-1 K11位連接的泛素化修飾增強，導致其蛋白酶體降解增加，從而抑制自噬的發(fā)生[32]。因此，NEDD4和RNF216對Beclin-1進行K11和K48位泛素化修飾，導致其降解并抑制自噬的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1蛋白K437位點可以發(fā)生K11連接的泛素化修飾，對其蛋白穩(wěn)定性是必需的；然而，抑制K437位點的K11連接的泛素化修飾能夠抑制Beclin-1的降解，促進細胞自噬的發(fā)生[33]。而去泛素化酶泛素特異性蛋白酶19能夠將K437位的K11泛素鏈降解，通過增強Beclin-1蛋白穩(wěn)定性而促進自噬的發(fā)生[34]。

研究表明，在小鼠胚胎成纖維細胞發(fā)生自噬的過程中，E3連接酶AMBRA1 能夠使Beclin-1發(fā)生K63位的泛素化修飾，從而增強VPS34活性；而Wiskott-Aldrich綜合征蛋白通過與Beclin-1相互作用來抑制Beclin-1泛素化修飾，以滅活VPS34活性，從而抑制自噬[35]，說明Beclin-1-VPS34復合物中Beclin-1的泛素化修飾不僅影響其自身功能，也能影響其“伙伴”的功能。在Toll樣受體4誘導的自噬過程中，TRAF6介導的Beclin-1 K63位泛素化修飾至關重要；而去泛素化酶腫瘤壞死因子誘導蛋白3則通過減少Beclin-1 K63位泛素化修飾，從而抑制Toll樣受體信號誘導的自噬。此外，用白細胞介素-1或干擾素刺激Raw 264.7細胞，或饑餓處理其他細胞，均能夠增強Beclin-1 K63位連接的泛素化修飾，促進自噬體的形成。這些結果表明了Beclin-1 K63位泛素化修飾在自噬的形成中具有重要的作用。

3.3其他分子VPS34是Ⅲ類磷脂酰肌醇激酶復合物中的催化亞單位，在自噬中起著重要的調節(jié)作用。它由催化亞基VPS34和調節(jié)亞基VPS15組成，能夠催化磷脂酰肌醇生成磷脂酰肌醇3-磷酸[36]。F盒富含亮氨酸的重復蛋白20(F-box and leucine-rich repeat protein 20，F(xiàn)BXL20)是一種F盒蛋白，與CUL1、S段激酶相關蛋白1(S-phase kinase-associated protein-1，SKP1)形成SKP1-CUL1-F盒蛋白質(SKP1-CUL1-F-box protein，SCF)復合物共同行使泛素連接酶功能。然而，細胞外信號是如何調節(jié)VPS34復合物及其下游信號轉導途徑的，目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在DNA損傷條件下，p53的激活能增加FBXL20轉錄，促進SCF復合物對VPS34的泛素化修飾，導致其降解，最終抑制自噬[36]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷導致有絲分裂停滯及CDK的活化，進而使VPS34發(fā)生磷酸化修飾，而泛素連接酶E3識別磷酸化的VPS34，使其發(fā)生泛素化修飾而被蛋白酶體識別、降解[37]。

mTORC1是自噬調控的上游分子，主要通過與ULK1復合物結合而抑制自噬的發(fā)生。由結節(jié)硬化復合物1(tuberous sclerosis 1，TSC1)與TSC2結合形成的TSC蛋白復合物具有GTP酶活性，是mTORC1的主要調控因子。有研究表明，活化的突觸前密度蛋白連接激酶能夠磷酸化TSC2，從而阻止TSC2與TSC1結合，抑制TSC復合物的形成，解除對mTORC1活性的抑制[38]。另外，RNF家族的一些成員通過K63位泛素鏈修飾而調節(jié)mTORC1的功能，如泛素連接酶RNF152 激活 mTORC1[39]。

ATG12不僅是一種自噬相關蛋白，其本身還是一種泛素樣蛋白，能夠直接被泛素化修飾，通過蛋白酶體降解而抑制自噬的發(fā)生。同時，ATG12、ATG5和ATG16L結合形成的復合物能夠發(fā)揮類泛素連接酶活性，參與LC3脂化過程，對自噬的形成是必需的。

4 結語

近年來，自噬已成為醫(yī)學研究的熱點，越來越多的研究者關注泛素化修飾在自噬發(fā)生過程中的調節(jié)功能。ATG蛋白參與自噬形成的各個階段，機體通過對ATG蛋白進行泛素化修飾來調控自噬的發(fā)生與終結。目前，關于ATG蛋白泛素化修飾的研究主要集中在Beclin-1和ULK1，其他參與自噬形成的ATG蛋白則鮮有報道。對于這些分子的泛素化修飾的研究，有助于進一步認識自噬發(fā)生及其終結的具體機制，為臨床治療自噬相關疾病提供理論基礎及可能的治療靶點。