卓祥龍

摘要目的：探討脊柱結(jié)核外周血中Th17細(xì)胞的數(shù)量變化及IL-17表達，尋求治療新靶點。方法：收治脊柱結(jié)核患者30例，選擇健康者30例，均檢測外周血單核細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例和血漿中IL-17含量。結(jié)果：脊柱結(jié)核組治療前Th17細(xì)胞數(shù)量高于健康組（P<0.05），結(jié)核組術(shù)后12個月的Th細(xì)胞數(shù)量和IL-17量較術(shù)前明顯降低（P<0.05）。結(jié)論：Th17細(xì)胞和IL-17因子是介導(dǎo)脊柱結(jié)核病情發(fā)展的重要免疫因素，Th17細(xì)胞和IL-17可能是脊柱結(jié)核患者在細(xì)胞免疫治療方面的一個新靶點。

關(guān)鍵詞Th17細(xì)胞；IL-17表達水平；脊柱結(jié)核

脊柱結(jié)核是常見的脊柱感染性疾病，隨病情進展可出現(xiàn)嚴(yán)重的脊柱和周圍軟組織破壞，甚至導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷，對患者的健康和生活產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。目前，雖有學(xué)者對脊柱結(jié)核損傷的發(fā)病機制進行了大量研究，但尚沒有確切的定論，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為可能與結(jié)核桿菌大量復(fù)制所造成的直接損傷和免疫介導(dǎo)等因素有關(guān)。Th17細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的CD4輔助T細(xì)胞亞群，參與多種炎癥感染及自身免疫疾病的組織損傷。研究表明，肺結(jié)核患者的胸水及外周血中可檢測到IL-17 mRNA表達，且外周血IL-17的表達比正常對照組顯著增高，組織細(xì)胞中有IL-17蛋白表達，組織中存在Th17細(xì)胞，提示Th17細(xì)胞亞群及其效應(yīng)分子IL-17參與了結(jié)核的病理過程。本項目目的是初步探討脊柱結(jié)核外周血中Th17細(xì)胞的數(shù)量變化及IL-17表達情況的分析，并尋求脊柱結(jié)核的治療新靶點。

資料與方法

樣本采集及處理：分別于術(shù)前及術(shù)后1周、1個月、6個月、12個月采集30例脊柱結(jié)核患者（年齡30～71歲）外周血標(biāo)本，并按上述時間點采集30例健康者的外周血作為對照，每例抽取30 mL外周血，在血液標(biāo)本中加入人淋巴細(xì)胞分層液后離心處理（室溫，2 000 rpm，30 min），分離出外周血單核細(xì)胞及血漿，血漿于低溫保存，待ELISA法檢測IL-17。本研究經(jīng)柳州市工人醫(yī)院倫理委員會審批同意。

主要試劑及儀器：人細(xì)胞因子IL-17酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技公司，PE-抗人CD4單克隆抗體、FITC-抗人IL-17單克隆抗體購于上海谷研科技有限公司，流式細(xì)胞儀為BD FACSCalibur flowcytomeler，軟件為FCS ExpressV3。

流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單核細(xì)胞中Thl7細(xì)胞比例：取外周血制成懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10/mL，接種于24孔板，加入PMA（50 ng/mL；Mdrich，St.Louis，MO）、離子霉素（1μg/mL）和莫能新（2μmol/mL），置于恒溫箱（37℃，5%C02）培養(yǎng)6 h。加人PE-抗人CD4單克隆抗體10 μL，避光室溫染色30min，以4%多聚甲醛固定，破膜劑破膜后加FITC-抗人IL-17單克隆抗體10μL，室溫染色30 min，洗滌后重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測。

IL-17水平測量：取上述血漿用ELISA法測量IL-17含量，具體按照ELISA試劑盒（R&D Systems，Minneapolis，MN）說明書的方法進行，所有標(biāo)本均雙份測量，讀取酶標(biāo)儀450 nm處0D值。

統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 13.0分析，計量資料采用（x±s）表示，t檢驗，計數(shù)資料使用率（%）表示，x2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一般資料比較：所有受試者均為漢族，30例脊柱結(jié)核患者中，男16例，女14例，年齡19～68歲，平均45.5歲；健康對照組中，男15例，女15例，年齡18～66歲，平均46.2歲。脊柱結(jié)核患者組與健康對照組在人種、年齡、性別方面相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

外周血單核細(xì)胞中Thl7細(xì)胞比例：流式細(xì)胞儀檢測外周血單核細(xì)胞中CD4及IL-17均陽性的細(xì)胞為Th17細(xì)胞的比例。比較脊柱結(jié)核及健康者各個時期的Th17細(xì)胞比例：脊柱結(jié)核患者術(shù)前及術(shù)后1周、1個月、6個月、12個月的Th細(xì)胞比例分別為（9.2±0.9）%、（9.0±0.8）%、（4.2±0.3）%、（3.6±0.3）%、（2.1±0.2）%，健康者術(shù)前及1周、1個月、6個月、12個月的Th細(xì)胞比例分別為（1.8±0.2）%、（2.2±0.2）%、（2.4±0.3）%、（2.1±0.2）%、（1.9±0.1）%，脊柱結(jié)核組治療前的Thl7細(xì)胞數(shù)量明顯高于健康組（P<0.05），但結(jié)核組術(shù)后12個月的Th細(xì)胞數(shù)量較術(shù)前明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

血漿IL-17水平：ELISA法測量結(jié)果顯示：脊柱結(jié)核患者術(shù)前及術(shù)后1周、1個月、6個月、12個月的IL-17水平為（70.25±6.35）ng/L、（68.15±7.50）ng/L、（53.28±6.55）ng/L、（32.45±5.52）ng/L、（31.75±4.65）ng/L，健康者術(shù)前及1周、1個月、6個月、12個月的IL-17分別為（34.36±4.38）ng/L、（41.15±4.55）ng/L、（43.56±5.85）ng/L、（40.12±6.45）ng/L、（38.66±6.15）ng/L，脊柱結(jié)核組治療前的IL-17量明顯高于健康組（P<0.05），結(jié)核組術(shù)后12個月的IL-17量較術(shù)前明顯降低（P<0.05），見圖2。

討論

針對不同病原體的免疫應(yīng)答免疫細(xì)胞會起不同的特化作用，CD4+T細(xì)胞可產(chǎn)生不同細(xì)胞因子，發(fā)揮特異性免疫應(yīng)答作用，其中INF-7可活化巨噬細(xì)胞，殺滅留在巨噬細(xì)胞中的病原體。Th17細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞中的一個亞群，因其分泌的IL-17細(xì)胞因子而得名。本研究檢測脊柱結(jié)核外周血中Th17細(xì)胞比例，結(jié)果表明結(jié)核患者較健康者血液中Th17細(xì)胞顯著增高，且手術(shù)治療去除脊柱相關(guān)病灶后，外周血中Th細(xì)胞的含量會一定程度下降；同時通過ELISA法檢測表明，脊柱結(jié)核患者血漿中IL-17水平也較健康者顯著增高，表明Th17細(xì)胞及IL-17參與了脊柱結(jié)核的免疫應(yīng)答，并在脊柱結(jié)核病灶的形成及病情發(fā)展中發(fā)揮了一定的作用。

研究表明，Th17細(xì)胞分泌的IL-17通過對中性粒細(xì)胞的趨化來殺滅細(xì)胞外的病原體。然而，結(jié)核桿菌是一種浸潤細(xì)胞內(nèi)的病原體，這種胞內(nèi)菌IL-17的作用機制仍然不明，最近的研究表明IL-17能夠增強患者對一些胞內(nèi)病原體的免疫力，但遠(yuǎn)不如對胞外菌感染的抗菌效果明顯，如感染亞致死量沙門氏菌的IL-17缺失鼠，其脾和肝中病菌量增加。本研究通過ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，健康患者外周血中檢測不到IL-17蛋白的高表達，但脊柱結(jié)核患者體內(nèi)檢測到大量的IL-17蛋白，且手術(shù)后時間越長的患者中外周血IL-17水平越較入院初期明顯降低，提示脊柱結(jié)核患者外周血中可能存在記憶性的產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞，這些細(xì)胞在感染結(jié)核后分泌IL-17。同時，血漿IL-17水平與Th17細(xì)胞在患者術(shù)前及術(shù)后數(shù)量變化趨勢一致，提示血漿IL-17的表達增加與Th17細(xì)胞的比例增高相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞比例和IL-17水平在脊柱結(jié)核病灶清除術(shù)后都較入院初期降低，提示脊柱結(jié)核病灶的擴大可能與Th17細(xì)胞和IL-17介導(dǎo)的免疫應(yīng)答有關(guān)。脊柱結(jié)核病灶被巨噬細(xì)胞吞噬，這種胞內(nèi)結(jié)核菌的存在和增殖引發(fā)的宿主免疫反應(yīng)是影響脊柱結(jié)核病灶擴大和轉(zhuǎn)歸的決定性因素。結(jié)核較為有特征性的病理改變?yōu)榻Y(jié)核性肉芽腫，如干酪壞死組織中含有大量結(jié)核菌，可長期休眠。IL-17能通過中性粒細(xì)胞遷移到病灶周圍來抗感染，從而發(fā)揮免疫保護作用，但過多的中性粒細(xì)胞也會引起脊柱結(jié)核病灶的擴大及形成冷膿腫。研究表明，在活動性結(jié)核患者體內(nèi)中性粒細(xì)胞是最主要的受感染細(xì)胞類型，這些細(xì)胞也是結(jié)核桿菌長期潛伏的場所，在適宜的條件下能再度繁殖，造成病灶擴大或病情反復(fù)。

綜上所述，Th17細(xì)胞和IL-17在脊柱結(jié)核患者體內(nèi)的含量遠(yuǎn)高于健康者，且經(jīng)手術(shù)治療后，Th17細(xì)胞和IL-17含量在一定時期內(nèi)會有所下降，表明Th17細(xì)胞和IL-17是介導(dǎo)脊柱結(jié)核病情發(fā)展及病灶擴大的重要免疫因素，因此，Th17細(xì)胞和IL-17是脊柱結(jié)核患者在細(xì)胞免疫治療方面的一個新靶點。如何控制Th17細(xì)胞和IL-17在免疫保護及免疫破壞方面的平衡將為脊柱結(jié)核的防治方法提供新思路。endprint