吳煒景　張家敏　李立平

[摘要]目的構(gòu)建急性肺損傷體外細(xì)胞模型。方法以TNF-α 10ng/mL刺激肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞上清液中IL-4、IL-1 B濃度，比色法檢測丙二醛濃度、總超氧化物歧化酶活力，RT-PCR及免疫印跡法分別檢測NF-K B mRNA及蛋白的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果以TNF-α刺激A549細(xì)胞，細(xì)胞上清液IL-1β、IL-4濃度上升；細(xì)胞內(nèi)丙二醛增多，超氧化物歧化酶活力下降；NF-кB在基因及蛋白水平表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。結(jié)論以TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)放大、氧化應(yīng)激失衡、NF-кB通路活化、細(xì)胞凋亡增加，符合急性肺損傷的主要特點(diǎn)，可作為ALI體外細(xì)胞模型。

[關(guān)鍵詞]急性肺損傷；細(xì)胞模型；炎癥反應(yīng)；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞；核因子кB；

[中圖分類號]R563.1；R563.8 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]2095-0616（2017）17-30-03

急性肺損傷（acute lung iniury，ALI）是臨床常見急危重癥，以進(jìn)行性加重的呼吸困難、頑固的低氧血癥為臨床特征，其嚴(yán)重階段可發(fā)展為成人呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。感染、有害物質(zhì)吸入、外傷、休克、中毒等多種非心源性致病因素是引起急性肺損傷的常見因素，ALI/ARDs缺乏特效治療，發(fā)病率及病死率均處于高水平，因而其發(fā)病機(jī)制研究仍受科學(xué)家重視。急性肺損傷模型構(gòu)建是ALI機(jī)制研究的基礎(chǔ)，在細(xì)胞模型上進(jìn)行研究，再將實(shí)驗(yàn)成果在動物模型上進(jìn)行驗(yàn)證，有利于降低動物實(shí)驗(yàn)的成本，提高成功率。本研究結(jié)合急性肺損傷發(fā)生時(shí)，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、通路激活等方面的特點(diǎn)，對ALI細(xì)胞模型的構(gòu)建進(jìn)行探討。

1材料與方法

1.1材料

A549細(xì)胞由福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶來自于Hyclone公司，重組人腫瘤壞死因子-α購自美國的Pepro Tech公司，NF-кB抗體、內(nèi)參βactin抗體購自美國CST公司，Trizol購買于Invitrogen公司，PCR引物由上海英駿公司合成，RT-PCR及熒光定量PCR試劑購自TaKaRa公司，細(xì)胞因子IL-4、IL-1 β ELISA法檢測試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、SOD及MDA檢測試劑盒、BCA法蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天公司。AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

A549細(xì)胞在含100U/mL鏈霉素、100U/mL青霉素、10%滅活小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2～3天傳代1次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。將細(xì)胞以2×10⁵/mL接種于6孔板，待貼壁細(xì)胞融合度達(dá)到70%，實(shí)驗(yàn)組更換為含腫瘤壞死因子-α（10ng/mL）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，對照組未進(jìn)行TNF-α刺激，24小時(shí)后分別收取培養(yǎng)上清及細(xì)胞標(biāo)本備檢。

1.3Real-time RT-PCR檢測NNF-кB基因表達(dá)水平

TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR反應(yīng)體系（20μL）：5×酶混合物4μL，RNA 1μg，DEPC水補(bǔ)足至20μL；逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃，15min，85℃，5sec。real-time PCR反應(yīng)體系（25μL）：2×含酶混合物12.5μL，上、下游引物各1.0μL，cDNA 2.0μL，超純水8.5μL。real-time PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s（40cycles）。設(shè)定在每個(gè)循環(huán)的退火期結(jié)束后程序自動記錄該循環(huán)的熒光值，以表示在該循環(huán)結(jié)束時(shí)PCR產(chǎn)物的量。同時(shí)擴(kuò)增β-actin、NF-кB，以β-actinmRNA為參照進(jìn)行相對定量，相對定量計(jì)算由Rotor-Gene Q 1.7.94軟件完成。相關(guān)引物序列見表1。

1.4免疫印跡法檢測各組細(xì)胞總蛋白NF-кB的水平

按照說明書，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入loading buffer后，金屬浴100℃，5分鐘變性后，取20ug進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)90min，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，置于一抗（NF-KB抗體1：1000、內(nèi)參β-actin抗體1：400）中4℃孵育過夜，TBST漂洗后，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1：2000）室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL法發(fā)光，顯影及曝光。采用QuantityOne軟件分析條帶灰度值，計(jì)算NF-кB與β-actin的灰度比值，以此表示NF-кB蛋白相對量。

1.5酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測細(xì)胞上清液中IL-4、IL-1β的含量

收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心并取得上清，根據(jù)說明書操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定各樣本OD值（波長450nm），根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-4、IL-1β的含量。

1.6氮藍(lán)四唑比色法檢測細(xì)胞內(nèi)總超氧化物歧化酶（SOD）活力

裂解各組A549細(xì)胞并測定蛋白濃度，根據(jù)說明書操作，酶標(biāo)儀測定各樣本OD值（波長450nm），根據(jù)公式計(jì)算單位重量蛋白的SOD活力單位，結(jié)果以“Unit/mg蛋白”為單位表示。

1.7硫代巴比妥酸比色法檢測細(xì)胞的丙二醛（MDA）濃度

裂解各組A549細(xì)胞，測定蛋白濃度，結(jié)合說明書操作，酶標(biāo)儀測定各樣本OD值（波長530nm），計(jì)算獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而計(jì)算樣本MDA濃度，除以樣本總蛋白量，即“μmoL/mg”為MDA水平。

1.8流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率（AnnexinV/PI法）

收集各組細(xì)胞，根據(jù)說明書將細(xì)胞孵育染色后上機(jī)檢測，Annenxin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。根據(jù)所獲數(shù)據(jù)計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS21.0軟件包，計(jì)量資料以（xs）表示，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組NF-к B mRNA相對表達(dá)量較對照組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組NF-кB蛋白相對表達(dá)量較對照組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組IL-1β濃度較對照組明顯上調(diào)，實(shí)驗(yàn)組IL-4濃度較對照組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組SOD濃度較對照組明顯下降，實(shí)驗(yàn)組MDA濃度較對照組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較對照組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2，圖1。

3討論

肺泡上皮細(xì)胞凋亡是ALI/RDS重要的病理生理過程之一。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致呼吸膜完整性受損，肺表面活性物質(zhì)無法發(fā)揮正常作用，繼而出現(xiàn)肺泡萎陷、微肺不張及肺水腫。因此，以肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞作為研究對象進(jìn)行ALI模型構(gòu)建具有代表性。

TNF-α是重要的前炎癥因子，在ALI炎性反應(yīng)中釋放最早，能促發(fā)其他細(xì)胞因子的釋放。因此，本課題以TNF-α作為單一刺激因素，嘗試模仿急性肺損傷時(shí)的細(xì)胞炎癥-氧化損傷。IL-1β出現(xiàn)在急性呼吸窘迫綜合征早期，可與TNF-α協(xié)同啟動炎性反應(yīng)，是重要的促炎細(xì)胞因子；IL-4是作為抗炎細(xì)胞因子，能通過抑制IL-1、TNF-α等炎癥介質(zhì)的合成，或者干預(yù)某些炎癥細(xì)胞的功能而發(fā)揮抗炎作用。氧化應(yīng)激也是ALI/ARDS發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一，脂質(zhì)過氧化生成大量新的ROS和高細(xì)胞毒性的丙二醛（MDA），測定丙二醛濃度可反應(yīng)細(xì)胞損傷程度；超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于生物體內(nèi)，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，是重要的氧自由基清除劑。本研究結(jié)果表明，經(jīng)TNF-α刺激的A549細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組），其促炎因子IL-1β和抗炎因子IL-4濃度上升，提示炎癥反應(yīng)水平被放大；其氧化物MDA生成增加，抗氧化物SOD消耗增加，提示氧化應(yīng)激失衡；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率較對照組升高；上述結(jié)果均符合ALI/ARDS發(fā)生、發(fā)展過程中TNF-α啟動“瀑布式炎癥級聯(lián)反應(yīng)”并繼發(fā)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡的病理生理特點(diǎn)。

NF-кB作為經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與了炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡等生理病理過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TNF-α可上調(diào)NF-KBmRNA.活化NF-кB，提示NFкB信號通路參與TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程。

綜上本研究以TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549，成功地在體外細(xì)胞上模擬了急性肺損傷發(fā)生時(shí)過度炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞通路活化的病理生理過程，為急性肺損傷細(xì)胞模型研究提供參考依據(jù)。

（收稿日期：2017-08-23）