陳芳+王倩

[摘要] 目的 研究脂氧素A4及其受體對(duì)大鼠急性肺損傷Na+-K+-ATP酶的影響及機(jī)制。 方法 將大鼠隨機(jī)分為7組：①對(duì)照組；②油酸（OA）組；③油酸+脂氧素A4（OA+LX）組；④OA+Alcohol組；⑤油酸+BML-111組（OA+BML-111組）；⑥油酸+脂氧素A4+BOC-2（OA+LX+BOC-2）組；⑦OA+DMSO組。機(jī)械通氣1 h后處死，取肺組織測(cè)定Na+-K+-ATP酶α1、β1亞基蛋白表達(dá)和Na+-K+-ATP酶活性。 結(jié)果 與OA組比較，OA+LX組和OA+BML-111組肺組織Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.05），Na+-K+-ATP酶活性明顯增強(qiáng)（P<0.05）；與OA+LX組比較，BOC-2抑制Na+-K+-ATP酶的活性（P<0.01）。 結(jié)論 脂氧素通過(guò)上調(diào)Na+-K+-ATP酶蛋白表達(dá)及活性減輕油酸誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷，其作用機(jī)制與脂氧素受體（ALX）相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] Na+-K+-ATP酶；急性肺損傷；脂氧素；脂氧素受體

[中圖分類(lèi)號(hào)] R563 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）23-0021-05

[Abstract] Objective To study the effect of lipoxin A4 and its receptor on Na+-K+-ATPase in acute lung injury. Methods SD rats were divided randomly into seven groups： ①control group； ②OA group； ③OA+LX group； ④OA+Alcohol group； ⑤OA+BML-111 group； ⑥OA+LX+BOC-2 group； ⑦OA+DMSO group. After 1 h of mechanical ventilation， lung samples were harvested. The protein of lung tissue samples was isolated to measure Na+-K+-ATPase protein expression and Na+-K+-ATPase activity. Results Compared with OA group， Na+-K+-ATPase β1 subunit protein expression and Na+-K+-ATPase activity were significantly increased in OA+LX group and OA+BML-111 group. Compared with OA+LX group， the beneficial effects of lipoxinA4 were abrogated by BOC-2（P<0.01）. Conclusion Lipoxin can up-regulated Na+-K+-ATPase β1 subunit protein expression and Na+-K+-ATPase activity in acute lung injury， and its mechanism is through ALX cGMP.

[Key words] Na+-K+-ATPase； Acute lung injury； Lipoxin； Lipoxin receptor

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）是臨床常見(jiàn)的急危重癥，病死率高達(dá)50%[1-3]。其主要病理變化為肺組織大量炎性浸潤(rùn)和肺泡-毛細(xì)血管屏障損傷引起的肺水清除障礙、肺水積聚。肺泡內(nèi)水腫液的及時(shí)主動(dòng)清除是治療急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征的關(guān)鍵措施[4]。Na+-K+-ATP酶在水腫液主動(dòng)清除過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用[5-9]。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞基底膜Na+-K+-ATP酶將細(xì)胞內(nèi)Na+主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至肺間質(zhì)，形成Na+濃度滲透梯度，進(jìn)而產(chǎn)生肺泡腔內(nèi)液體重吸收。另外，研究發(fā)現(xiàn)，Na+-K+-ATP酶參與形成和維持肺泡上皮的緊密連接，從而影響肺泡上皮細(xì)胞的屏障功能[10-13]。因此，該酶功能的變化和調(diào)節(jié)對(duì)肺水的清除起著至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)研究促炎癥消退介質(zhì)脂氧素對(duì)大鼠急性肺損傷肺組織Na+-K+-ATP酶的調(diào)控及可能機(jī)制，為治療急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物

SPF級(jí)健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠56只，體重200～250 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物許可證：X1004258）。

1.2 主要試劑與儀器

脂氧素A4（lipoxin A4，LXA4）購(gòu)自美國(guó) Cayman，脂氧素A4受體激動(dòng)劑（BML-111）和脂氧素A4受體抑制劑（BOC-2）均購(gòu)自美國(guó)Biomol-Enzo Life Sciences，抗Na+-K+-ATP酶α1和β1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，油酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。小型動(dòng)物呼吸機(jī)TKF-200c為江西麻醉呼吸設(shè)備公司，蛋白電泳系統(tǒng)為美國(guó)BioRAD，凝膠成像分析系統(tǒng)為英國(guó)的GDS 8000。

1.3 油酸損傷模型的建立

取SD雄性大鼠，戊巴比妥鈉麻醉后行氣管插管，機(jī)械通氣。經(jīng)股靜脈分別注射生理鹽水或純油酸0.03 mL/kg。100%氧氣機(jī)械通氣1 h后，肺組織HE染色，透射電鏡下觀察。

1.4 動(dòng)物分組及給藥

雄性SD大鼠隨機(jī)分為7組，每組8只：①空白對(duì)照組：股靜脈注入等體積的0.9%生理鹽水；②油酸組（oleic acid group，OA 組）：股靜脈注入0.03 mL/kg油酸；③油酸+脂氧素A4組（oleic acid+lipoxin group，OA+LX組）：股靜脈注入0.03 mL/kg油酸形成急性肺損傷10 min后，經(jīng)股靜脈注入脂氧素A4 2 μg/kg；④溶劑對(duì)照組（OA+Alcohol組）：股靜脈注入0.03 mL/kg油酸10 min，乙醇（Alcohol，脂氧素A4的溶劑）20 μL/kg經(jīng)股靜脈注入；⑤油酸+BML-111組（OA+BML-111組）：0.03 mL/kg油酸刺激10 min后，BML-111（1 mg/kg，脂氧素A4受體激動(dòng)劑）股靜脈注入；⑥油酸+脂氧素A4+BOC-2組（OA+LX+BOC-2組）：股靜脈注射0.03 mL/kg油酸與2 μg/kg脂氧素A4后，BOC-2（600 ng/kg）經(jīng)股靜脈注射；⑦溶劑對(duì)照組（OA+DMSO組）：股靜脈注入0.03 mL/kg油酸10 min，經(jīng)股靜脈注入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（BML-111和BOC-2的溶劑）。大鼠機(jī)械通氣1 h，腹主動(dòng)脈放血處死，分離肺組織置液氮中速凍，然后-80℃保存。

1.5 檢測(cè)Na+-K+-ATP酶α1、β1亞基蛋白表達(dá)

肺組織勻漿后提取蛋白并定量，加蛋白上樣緩沖液，煮沸后保存。加入SDS-PAGE膠孔中進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。最后加入抗Na+-K+-ATP酶α1和β1抗體（1∶1000），4℃過(guò)夜；第2天洗膜，加入二抗（1∶5000），室溫孵育1 h；洗滌，ECL顯影、曝光。

1.6 Na+-K+-ATP酶活性檢測(cè)

ATP酶分解ATP為ADP、AMP和Pi，通過(guò)測(cè)定Pi的量判斷ATP酶的活性。ATP酶活性單位以每小時(shí)每毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生1 mmol Pi的量定義為一個(gè)ATP酶活力單位。按微量Na+-K+-ATP酶試劑盒（南京建成）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組樣本比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 油酸肺損傷模型建立

對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清楚，支氣管黏膜上皮排列整齊，肺泡壁無(wú)明顯增厚，肺泡腔干凈、無(wú)明顯滲出，而油酸（OA）組肺組織充血明顯，肺泡間質(zhì)有炎性浸潤(rùn)，肺泡壁增寬，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)出血和滲出（封三圖4）。

2.2 脂氧素A4對(duì)油酸誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠Na+-K+-ATP酶的影響

與對(duì)照組比較，OA組Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.05）；與OA組和OA+Alcohol組比較，油酸+脂氧素組（OA+LX）Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.05）；OA組、OA+Alcohol組和油酸+脂氧素組（OA+LX）Na+-K+-ATP酶α1亞基蛋白表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖1A）。

與對(duì)照組比較，OA組Na+-K+-ATP酶活性增強(qiáng)（P<0.05）；與OA組和OA+Alcohol組比較，油酸+脂氧素組（OA+LX）Na+-K+-ATP酶活性顯著增強(qiáng)（P<0.01）（圖1B）。

2.3 BML-111 對(duì)油酸誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠Na+-K+-ATP酶的影響

與空白對(duì)照組比較，OA組Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.05）；與OA組和OA+DMSO組比較，油酸+BML-111組Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.05）；OA組、OA+DMSO組、油酸+BML-111組Na+-K+-ATP酶α1亞基蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

與空白對(duì)照組比較，OA組Na+-K+-ATP酶活性增強(qiáng)（P<0.05）；與OA組和OA+DMSO組比較，油酸+BML-111組Na+-K+-ATP酶活性顯著增強(qiáng)（P<0.05）。

2.4 BOC-2 對(duì)油酸誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠Na+-K+-ATP酶活性的影響

與OA組比較，油酸+脂氧素組Na+-K+-ATP酶活性增強(qiáng)（P<0.01）；與油酸+脂氧素組相比，BOC-2抑制Na+-K+-ATP酶的活性（P<0.01）。

3 討論

ALI/ARDS是一種急性呼吸衰竭綜合征，雖然醫(yī)療條件和技術(shù)不斷發(fā)展，但其病死率仍然極高[14，15]。學(xué)者們一直在探索尋找新的治療ALI/ARDS的策略和方法。肺水腫是內(nèi)毒素性肺損傷并發(fā)急性呼吸功能衰竭的主要病理基礎(chǔ)，肺泡水腫液的及時(shí)主動(dòng)清除對(duì)急性肺損傷的預(yù)后有重要影響。Na+-K+-ATP酶是主要位于細(xì)胞膜上的跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有維持細(xì)胞內(nèi)外鈉鉀濃度梯度作用，是促進(jìn)肺水沿著滲透梯度重吸收的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，Na+-K+-ATP酶主要由α亞基和β亞基構(gòu)成。α亞基為催化亞基，主要通過(guò)水解ATP提供能量完成細(xì)胞內(nèi)Na+和細(xì)胞外K+交換，β亞基為調(diào)節(jié)亞基，控制酶組裝和鑲嵌到質(zhì)膜[16]，并維持細(xì)胞屏障功能，在肺水腫形成和消退過(guò)程中具有重要作用。

脂氧素（lipoxins，LXs）為花生四烯酸（arachidonic acid，AA）脂加氧酶（lipoxygenase）的代謝產(chǎn)物，作為炎癥消退過(guò)程中產(chǎn)生的最重要的內(nèi)源性抗炎促消退介質(zhì)，脂氧素抑制中性粒細(xì)胞的趨化；調(diào)控炎癥因子的平衡；促進(jìn)損傷組織的修復(fù)，防止其纖維化；促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡及巨噬細(xì)胞的吞噬，因而稱(chēng)為炎癥反應(yīng)的“剎車(chē)信號(hào)”[15，17]。脂氧素已被多種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)具有特異性肺保護(hù)作用，能夠減輕肺水腫，修復(fù)上皮細(xì)胞屏障功能[15，17，18]。作為重要的內(nèi)源性促消退介質(zhì)，脂氧素主要是與其受體（formyl peptide receptor-like 2，F(xiàn)PRL2/ALX）結(jié)合，從而對(duì)多種炎癥性疾病的預(yù)后產(chǎn)生影響。

我們前期的研究已經(jīng)證實(shí)，在內(nèi)毒素性肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞模型中，LXA4可以上調(diào)Na+-K+-ATP酶的mRNA表達(dá)和酶活性，并證實(shí)在肺組織存在LXA4受體ALX表達(dá)[19]。本實(shí)驗(yàn)則建立肺損傷動(dòng)物模型，研究LXA4及其受體激動(dòng)劑和受體抑制劑對(duì)內(nèi)毒素性肺損傷Na+-K+-ATP酶的影響，從而進(jìn)一步探討LXA4促進(jìn)肺水吸收的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在油酸誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中，脂氧素受體激動(dòng)劑（BLM-111）與脂氧素一樣，具有一定的肺保護(hù)作用，都能提高Na+-K+-ATP酶β1亞基蛋白表達(dá)和Na+-K+-ATP酶活性。有學(xué)者研究證實(shí)，BLM-111對(duì)出血性休克和機(jī)械損傷性肺損傷也具有促炎癥消退作用[20，21]。Tang M等[14]研究發(fā)現(xiàn)，BLM-111可以減輕內(nèi)毒素性肺損傷，保護(hù)細(xì)胞屏障功能。但這一作用被脂氧素受體抑制劑（BOC-2）拮抗，提示脂氧素A4對(duì)Na+-K+-ATP酶的作用是通過(guò)脂氧素A4受體（ALX）介導(dǎo)的。目前發(fā)現(xiàn)的脂氧素受體主要有ALX、peptido-LT receptors（CysLTR1）和核受體AhR。ALX 是脂氧素信號(hào)通路中首先被鑒別并克隆的G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptors，GPCR）。

本實(shí)驗(yàn)證明脂氧素A4及其受體激動(dòng)劑能夠上調(diào)油酸誘導(dǎo)的急性肺損傷Na+-K+-ATP酶蛋白的表達(dá)和酶活性，從而促進(jìn)肺水清除；脂氧素A4 的上述作用是通過(guò)與其受體（ALX）結(jié)合發(fā)揮作用的。我們的研究進(jìn)一步闡明了脂氧素A4及其受體對(duì)大鼠急性肺損傷Na+-K+-ATP酶的作用及促進(jìn)肺水重吸收的機(jī)制，為治療ARDS 提供新的策略和依據(jù)。

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（收稿日期：2016-05-28）