吳衛(wèi)鋒 蓋曉東

(南京市第二醫(yī)院，江蘇 南京 210003)

我國(guó)是慢性乙型肝炎(乙肝)高感染國(guó)家〔1〕，調(diào)查研究顯示，30%～50%的慢性乙肝患者合并肝脂肪變，其中以中老年人群為主〔2〕。目前關(guān)于慢性乙肝與肝脂肪變相互關(guān)系的研究多集中在流行病學(xué)資料，對(duì)合并肝脂肪變是否影響慢性乙肝抗病毒應(yīng)答的結(jié)論尚未一致〔3，4〕。本次研究擬探討合并肝脂肪變對(duì)慢性乙肝患者抗病毒療效的影響及可能機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2012年6月至2016年10月在南京市第二醫(yī)院確診為慢性乙肝的中老年患者90例，將其中合并肝脂肪變37例為肝脂肪變組，單純慢性乙肝53例為無(wú)肝脂肪變組。入選標(biāo)準(zhǔn)：①乙肝表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間>6個(gè)月，血清乙肝病毒(HBV)-DNA陽(yáng)性；②肝組織活檢確診為慢性乙肝但不限制是否合并肝脂肪變；③未接受抗病毒治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他類型肝炎病毒感染；②存在酒精肝、藥源性肝病、自身免疫性肝病等其他肝臟損傷因素者；③合并糖尿病，肝腎等重要器官功能障礙者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。收集活檢時(shí)兩組患者肝組織標(biāo)本，10%甲醛溶液固定后用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑 氫氧化銀氨液、硫酸鐵銨溶液購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司；內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、山羊血清、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)于赫澎(上海)生物科技有限公司；兔抗人乙肝核心抗原(HBcAg)單克隆抗體、兔抗人HBcAg單克隆抗體、生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G抗體購(gòu)于上海麥倉(cāng)生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝組織炎癥分級(jí) 取固定后的肝組織標(biāo)本常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片機(jī)4 μm連續(xù)切片后置于純水中，干凈的載玻片撈起后放入70℃烘箱中1 h。常規(guī)脫蠟、透明后行HE染色，中性樹(shù)膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織炎癥分級(jí)。

1.3.2氫氧化銀氨液浸染法觀察肝組織纖維化情況 切片脫蠟后，放入酸性高錳酸鉀溶液氧化3 min，蒸餾水沖洗；放入2%硫酸鐵銨溶液10 min，蒸餾水沖洗；向每張切片上滴加氫氧化銀氨溶液反應(yīng)10 min，蒸餾水沖洗后用20%甲醛溶液還原3 min，脫水、透明、中性樹(shù)膠封固。

1.3.3免疫組化檢測(cè)HBsAg、HBcAg表達(dá)情況 切片脫蠟后用磷酸緩沖液洗滌，每張切片上滴加100 μl過(guò)氧化物阻斷劑，室溫下靜置20 min，沖洗后滴加100 μl山羊血清，室溫下靜置20 min，沖洗后滴加兔抗人HBsAg、HBcAg單克隆抗體(1∶100稀釋)，37℃孵育2 h，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶500稀釋)，-4℃冷藏過(guò)夜，DAB顯色、蘇木精復(fù)染、中性樹(shù)膠封固，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件，計(jì)量資料組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組肝活檢前生化、血清、病毒學(xué)指標(biāo)比較 肝脂肪變組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TB)、直接膽紅素(DB)、高密度脂蛋白(HDL)、載脂蛋白(Apo)a水平明顯低于無(wú)肝脂肪變組(P<0.05)；肝脂肪變組低密度脂蛋白(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、Apob、尿酸(UA)水平明顯高于無(wú)肝脂肪變組(P<0.05)；兩組白蛋白(ALB)、空腹血糖(FBG)、HBV-DNA載量、乙肝e抗原(HBeAg)陽(yáng)性率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組肝活檢前生化、血清、病毒學(xué)指標(biāo)比較

2.2兩組炎癥和纖維化程度比較 肝脂肪變組炎癥和纖維化程度明顯低于無(wú)肝脂肪變組，中重度以上炎癥和纖維化程度比例明顯低于無(wú)肝脂肪變組(P<0.01)。見(jiàn)表2，圖1，圖2。

2.3兩組HBsAg、HBcAg表達(dá)強(qiáng)度和面積比較 HBsAg多表達(dá)于胞質(zhì)、漿膜內(nèi)，分為漿膜型、胞質(zhì)型，部分伴有包涵體型，單純胞膜上表達(dá)較少；HBcAg表達(dá)包括陰性、胞質(zhì)型、胞核型、漿核型，以漿核型為主(見(jiàn)圖3)。將陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度和面積均分別合并為1～2級(jí)(+～)、3～4級(jí)(～)以方便統(tǒng)計(jì)比較。結(jié)果顯示，肝脂肪變組HBsAg、HBcAg表達(dá)強(qiáng)度3～4級(jí)及表達(dá)面積3～4級(jí)的比例均明顯低于無(wú)肝脂肪變組(P<0.01)。見(jiàn)表3，圖3。

表2 兩組炎癥和纖維化程度比較〔n(%)〕

表3 兩組HBsAg、HBcAg表達(dá)強(qiáng)度和面積比較〔n(%)〕

與無(wú)肝脂肪變組比較：1)P<0.01

A：炎癥輕微，匯管區(qū)可見(jiàn)少量浸潤(rùn)及分散的小泡性脂肪細(xì)胞；B：界面炎癥，匯管區(qū)可見(jiàn)炎性浸潤(rùn)；C：肝細(xì)胞氣球樣病變，匯管區(qū)可見(jiàn)大量炎性浸潤(rùn)；D：肝細(xì)胞壞死，匯管區(qū)大量炎性浸潤(rùn)圖1 兩組不同炎癥程度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況(HE，×100)

A：匯管區(qū)纖維沉積，血竇周圍少量纖維化；B：匯管區(qū)和血竇輕微纖維化；C：匯管區(qū)芒狀纖維沉積，血竇周圍少量膠原纖維沉積；D：匯管區(qū)少量芒狀纖維沉積圖2 兩組不同纖維化程度(氫氧化銀氨液浸染法染色，×100)

A：HBsAg在肝脂肪變組細(xì)胞中漿膜型表達(dá)(×200)；B：HBcAg在肝脂肪變組細(xì)胞中漿核型表達(dá)(×200)；C：無(wú)肝脂肪變組HBsAg反應(yīng)強(qiáng)于肝脂肪變組(×100)；D：肝脂肪變組HBcAg反應(yīng)強(qiáng)度和面積下降(×100)圖3 免疫組化檢測(cè)HBsAg、HBcAg在肝組織中的表達(dá)情況

3 討 論

相關(guān)研究顯示，慢性乙肝合并肝脂肪變患者干擾素治療的效果偏低〔5〕，但影響機(jī)制尚未明確。有研究者認(rèn)為，該影響可能與肝細(xì)胞中脂肪堆積影響了正常細(xì)胞形態(tài)，造成干擾素與細(xì)胞膜接觸面積減少有關(guān)〔6〕。本次研究提示慢性乙肝患者出現(xiàn)肝脂肪變主要與宿主代謝異常有關(guān)，而且合并肝脂肪變患者肝損傷程度低于未合并者。

HBsAg、HBcAg在肝組織中表達(dá)與肝細(xì)胞損害程度密切相關(guān)〔7〕。本次研究中無(wú)論慢性乙肝患者是否合并肝脂肪變，肝細(xì)胞中HBsAg、HBcAg均主要分布于漿膜、漿核中，兩組抗病毒蛋白在肝細(xì)胞中的分布情況無(wú)明顯差異，提示肝脂肪細(xì)胞不影響乙肝病毒蛋白在肝組織中的分布位置。但HBsAg、HBcAg的表達(dá)強(qiáng)度和面積受脂肪細(xì)胞影響，提示脂肪的存在能夠減弱乙肝病毒蛋白在肝細(xì)胞中的表達(dá)。相關(guān)研究顯示，HBV進(jìn)入人體血液循環(huán)后最先感染肝細(xì)胞，在胞質(zhì)中分泌HBsAg、HBcAg等病毒抗原，當(dāng)累積到一定數(shù)量后可誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答，攻擊被感染的肝細(xì)胞〔8〕。因此可推測(cè)，在是否合并肝脂肪變抗原表達(dá)方式無(wú)明顯差異的前提下，合并肝脂肪變可明顯減弱HBsAg、HBcAg在肝細(xì)胞中的表達(dá)水平，同時(shí)減弱了病毒蛋白激活免疫應(yīng)答的能力，進(jìn)而減少了肝細(xì)胞被攻擊程度，在炎癥反應(yīng)較輕的同時(shí)也減弱了干擾素的抗病毒療效。今后的研究中可從免疫水平和病毒DNA水平進(jìn)一步驗(yàn)證以上觀點(diǎn)。

1孫 云.2015年3月-2016年3月臨滄市乙型病毒性肝炎流行特征及防控進(jìn)展〔J〕.中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué)，2017；16(1)：91-2.

2趙 帥，孫靜娜，代麗麗，等.老年慢性乙型肝炎患者用藥治療后乙肝病毒耐藥基因多位點(diǎn)變異〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2017；37(10)：2484-5.

3張 琨.慢性HBV感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)和乙肝慢性化關(guān)系〔D〕.濟(jì)南：山東大學(xué)，2016.

4劉 瑩.乙肝轉(zhuǎn)陰散在恩替卡韋分散片治療乙型肝炎肝硬化過(guò)程中的作用及其機(jī)制研究〔D〕.南寧：廣西中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

5倪紅霞，劉楠楠，姜 晶，等.慢性肝病肝穿活檢組織病理學(xué)研究〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2017；18(2)：197-200.

6喻慧銘，盛吉芳.e 抗原陰性慢性乙肝老年患者核苷類藥物停藥后的臨床和病毒學(xué)復(fù)發(fā)評(píng)估〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2016；36(6)：1393-5.

7邊瑞巖.2005～2014年濱州市乙型病毒性肝炎流行特征分析〔J〕.中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué)，2016；15(3)：275-6.

8郝 銳.恩替卡韋治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床觀察〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014；(5)：630-2.