肖瑛，曾令萍，張瑩瑩，王圓圓，石明雋，郭兵

（1.貴州醫(yī)科大學 病理生理學教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省婦幼保健院 病理科，貴 州 貴陽 550003）

隨著研究的深入，確立了炎癥反應在糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）中的作用，認為DN是一種自然免疫和慢性低度炎癥性疾病[1]。基于此，探討炎癥反應如何促進DM腎臟纖維化的作用逐漸受到重視。Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）是一種跨膜蛋白，與腎臟 炎癥細胞浸潤高度相關[2]。有研究表明，PKC信號通路參與TLR4致炎癥因子的分泌[3]。OM具有對抗炎癥、抗臟器纖維化的作用，但機制還不清楚。本研究旨在觀察OM對糖尿病（diabetes mellitus，DM）腎組織TLR4表達及炎癥反應的影響，探討OM抗炎、抗纖維化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物健康清潔級SD大鼠24只，雄性，體重（180±20）g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0004。

1.1.2 主要試劑鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）、anti-膠原蛋白Ⅳ購自美國Sigma公司，氧化苦參堿（Oxymatrine，OM）（牡丹江蓮花湖制藥有限責任公司，批號：100701），免疫組織化學兩步法檢測試劑、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒、一抗稀釋液、ECL、DMSO、牛血清白蛋白購自北京碧云天生物研究所，RIPA裂解液和PMSF購自北京索萊寶科技有限公司，PVDF膜、3 mm Whatman濾紙購自美國Millipore公司，anti-TLR4、anti-蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PKCα）及anti-β-actin購自武漢博士德生物技術有限公司，酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（北京科盈美科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 DM大鼠 模型的復制及分組將購買的大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為正 常對照組（NC組）和糖尿病組（DM組）。DM組大鼠一次性尾靜脈注射溶于pH 4.5，0.01 mol/L無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的STZ，劑量為55 mg/kg。注射后72 h尾靜脈采血測血糖，以血糖值≤16.7 mm mol/L為模型復制成功。氧化苦參堿組（OM組）大鼠從DM模型復制成功次日起OM 75 mg/（kg·d）灌胃，連續(xù)16周。劑量的選擇[4]：在高、中劑量（100和50 mg/kg）均有效的前提下，選擇兩者的中間劑量（75 mg/kg），該劑量相當于11.9 mg/（kg·d）。NC組尾靜脈注射STZ溶媒（pH 4.5，0.01 mol/L無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液）。每組8只大鼠，給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2.2 標本的收集各組大鼠飼養(yǎng)至16周，處死前代謝籠收集24 h尿，記錄尿量。禁食6 h，采用乙醚吸入麻醉，股動脈取血，4℃離心10min收集血清，-20℃保存供生化檢測；生理鹽水灌洗雙側腎臟，部分腎臟固定于4%多聚甲醛，制作石蠟切片，其余腎臟于-80℃保存供分子生物學檢測。

1.2.3 生化指標檢測采用氧化酶法測血清葡萄糖濃度，雙縮脲法測尿蛋白濃度，24 h尿蛋白量=尿蛋白濃度×24 h尿量，由貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院生化科全自動生化分析儀檢測。

1.2.4 腎組織形態(tài)學觀察將多聚甲醛固定的腎組織制成3μm厚的石蠟切片，予以蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）和Masson染色，普通光鏡下觀察腎組織形態(tài)結構改變及纖維化病變。

1.2.5 免疫組織化學染色法采用SP法檢測TLR4（1∶50）、PKCα（1∶50）及膠原蛋白Ⅳ，DAB顯色，蘇木精復染。

1.2.6 ELISA檢測按白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6） 和 腫 瘤 壞 死 因 子（tumor necrosis factor，TNF-α）ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 Western blot檢測Western blot檢測 TLR4、PKCα及膠原蛋白Ⅳ表達。取-80℃保存的腎皮質，在勻漿器中加入組織蛋白裂解液進行勻漿，12 000 r/min離心20min后取上清測蛋白含量。經SDS-PAGE分離，300 mA轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜，分別加入TLR4（1∶100）、PKCα（1∶100）及膠原蛋白Ⅳ（1∶1 000）的Ⅰ抗，4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后加入相應Ⅱ抗室溫孵育1 h，用ECL顯影曝光，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)曝光，Image Lab 5.1軟件分析圖像，以β-actin蛋白條帶作內參照，結果用靶蛋白/β-actin比值表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用單因素方差分析，若方差齊，則兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況及相關生化指標

DM大鼠模型復制成功后，逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象，而OM組大鼠多飲、多食、多尿現(xiàn)象得到改善。16周處死前取血測血糖，并收集處死前1天24 h尿檢測尿蛋白。3組大鼠血糖和尿蛋白水平比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=44.122和7.963，P=0.000和0.004）。進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，DM組血糖和24 h尿蛋白高于NC組（P＜0.05）；OM組血糖和24 h尿蛋白較DM組減少（P＜0.05），見圖1。

2.2 腎組織病理學變化

圖1 各組大鼠16周血糖和24 h尿蛋白變化

HE染色顯示，NC組腎臟結構清晰完整，DM組腎小管擴張，腎小管上皮細胞空泡變性，細胞萎縮和脫落，間質區(qū)增寬，而OM組病變明顯減輕。Masson染色顯示，NC組腎小球和腎小管完整清晰，而DM組腎臟結構排列不清，Masson染色陽性物質（深藍色）明顯增多，OM組大鼠腎臟病變有不同程度減輕。見圖2。

2.3 大鼠腎組織中TLR4、PKCα及膠原蛋白Ⅳ的表達

免疫組織化學結果顯示，TLR4和PKCα主要表達于大鼠腎小管上皮細胞，在NC組大鼠腎皮質中TLR4和PKCα表達極少，DM組可見大量陽性染色（棕黃色），而OM組腎組織中TLR4和PKCα蛋白表達較DM組減少。3組大鼠腎組織中TLR4和PKCα表達量比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=17.647和15.119，P=0.003和0.000）。進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，DM組TLR4和PKCα蛋白表達高于NC組（P＜0.05）；OM組腎組織中TLR4和PKCα蛋白的表達較DM組減少（P＜0.05）。見圖3～5。

免疫組織化學結果顯示，在NC組大鼠腎組織中膠原蛋白Ⅳ的棕黃陽性染色僅少量存在于細胞間質；DM組細胞間質中膠原蛋白Ⅳ表達增高；OM組大鼠腎組織膠原蛋白Ⅳ表達較DM組減少。3組大鼠腎組織中膠原蛋白Ⅳ表達量比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=26.758，P=0.000）。進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，DM組膠原蛋白Ⅳ表達高于NC組（P＜0.05）；OM組膠原蛋白Ⅳ表達較DM組減少（P＜0.05）。見圖 6。

2.4 各組大鼠腎組織勻漿中IL-6和TNF-α的表達

各組大鼠腎組織勻漿上清中IL-6和TNF-α含量比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=13.368和68.423，均P=0.000）。進一步兩兩比較用LSD-t檢驗， DM組IL-6和TNF-α含量高于NC組（P＜0.05）；OM組IL-6和TNF-α含量較DM組減少（P＜0.05），見附表。

圖2 各組大鼠腎組織形態(tài)學 （×200）

圖3 各組大鼠腎組織中TLR4的分布及表達

圖4 各組大鼠腎組織中PKCα的表達

圖5 各組大鼠腎組織中PKCα表達比較

圖6 各組大鼠腎組織中的膠原蛋白Ⅳ分布及表達

附表 各組大鼠腎組織勻漿中IL-6和TNF-α表達水平比較（n =8，pg/μg，±s）

附表 各組大鼠腎組織勻漿中IL-6和TNF-α表達水平比較（n =8，pg/μg，±s）

注：1）與NC組比較，P ＜0.05；2）與DM組比較，P ＜0.05

NC組 2.5±0.8 9.3±1.6 DM組 4.4±0.41） 23.0±2.81）

3 討論

來自臨床和實驗室的許多證據表明，發(fā)生在代謝紊亂與血流動力學異?；A上的炎癥反應與DN的進行性發(fā)展關系密切[5-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，DM大鼠血糖升高的同時，出現(xiàn)大量蛋白尿，膠原蛋白Ⅳ表達增多，提示DM大鼠出現(xiàn)腎纖維化病理改變。DM大鼠腎組織中炎癥因子IL-6、TNF-α也增多，表明炎癥因子參與DN的發(fā)生、發(fā)展。

TLRs是一組參與傳遞細胞膜跨膜信號的的受體蛋白，TLR4是TLRs中關注度最高的一種。TANG等[5]研究發(fā)現(xiàn)，DN患者腎組織中TLR4高表達于腎小管上皮細胞，且與間質巨噬細胞浸潤程度和糖化血紅蛋白呈正相關。另外在DM大鼠的研究中也發(fā)現(xiàn)，TLR4和炎癥因子單核細胞趨化蛋白和mRNA的表達較正常對照組上調[8]。相反，單側腎切除后，STZ誘導的TLR4-/-小鼠較野生型蛋白尿減少，腎功能損害減輕，腎皮質NF-κB活化、小管C-C趨化因子配體2的表達，以及間質巨噬細胞浸潤減少[2]。以上研究表明，TLR4與腎臟炎癥細胞浸潤程度相關，TLR4通路可能介導DM時腎臟的炎癥浸潤。本實驗中，DM組TLR4高表達，TLR4信號通路激活，促進IL-6、TNF-α炎癥因子的釋放，提示DM大鼠腎組織中IL-6、TNF-α的產生與TLR4信號通路有關，并因此促進腎間質炎癥的發(fā)生、發(fā)展。

另有研究顯示，TLR4的配體LPS可通過對PKC的活化，最終啟動NF-κB的轉錄，誘發(fā)炎癥反應，而且PKCα能夠加強中性粒細胞中TLR4介導的NF-κB活化[9]，利用siRNA干擾技術抑制腎小管上皮細胞TLR4的表達，可減弱高糖誘導的IκB/NF-κB激活，提示PKC/TLR4通過抑制IκB/NF-κB信號通路，介導高糖誘導腎小管炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展[10]。因此，提示PKCα可能參與TLR4依賴的信號途徑的激活。本實驗中，免疫組織化學和Western blot檢測結果顯示，TLR4和PKCα主要表達于大鼠腎小管上皮細胞，在NC組大鼠腎皮質中TLR4和PKCα表達極少；DM大鼠腎小管上皮細胞中可見大量陽性染色；與NC組相比，DM組腎組織中TLR4和PKCα的表達增多，兩者的表達呈平行關系，考慮高糖可能通過激活PKCα信號通路，促進TLR4及其下游炎癥因子的大量表達，發(fā)揮致炎、致纖維化的作用，但兩者確切的關系還需進一步證實。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，OM干預高糖培養(yǎng)的NRK52E細胞后，α-平滑肌肌動蛋白mRNA和蛋白表達水平降低，E-鈣粘素mRNA和蛋白的表達增高，提示OM可抑制腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化的發(fā)生，改善纖維化程度[11]。GUO等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，OM可以改善DN狀態(tài)下的氧化應激反應，減少糖基化終末產物及炎癥因子的產生。但OM的抗炎、抗纖維化機制還不甚清楚。本實驗結果顯示，OM組腎組織中TLR4和PKCα的表達較DM組減少，膠原蛋白Ⅳ表達下調，大鼠腎組織勻漿上清中IL-6和TNF-α含量減少，提示OM可抑制DM大鼠腎組織PKCα、TLR4的表達及炎癥反應，減輕高糖致炎、致纖維化作用。但是PKCα是直接還是間接地促進TLR4及其下游炎癥因子的表達增加，進而發(fā)揮促炎、促纖維化的作用機制，還需一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)，OM可以降低DM大鼠的血糖，表明OM具有降低血糖的作用。其機制可能為：①OM可能可以刺激胰島素釋放或再生胰島β細胞，并且與OM可增加血清胰高血糖素樣肽-1有關[13]；②OM可以提高靶組織對胰島素的敏感性，可能與OM可增加骨骼肌中肌肉葡萄糖轉運蛋白-4有關[14]。但具體機制還需進一步研究。

綜上所述，OM可抑制高糖介導的炎癥反應和致纖維化作用，其機制可能與OM降低血糖，抑制PKCα的信號激活，減少TLR4蛋白表達，進而使腎組織局部炎癥因子的分泌減少，從而緩解DN纖維化病變的發(fā)生、發(fā)展。

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