譚玉萍，張鵬飛，馮玉清，楊益寶，梁煒，楊紅梅，梁愛武，鄧禎

（廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院 1.呼吸內科，2.檢驗科，廣西 南寧 5 30001）

銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，GBE）近年來被廣泛應用于心腦血管、肺部疾病的治療，但其作用機制尚未完全清楚。紅霉素是大環(huán)內酯類抗生素，其除了抗感染作用之外，還有抗炎及抗氧化作用。目前，關于紅霉素抗炎的作用機制已有較多研究，因此本研究選用紅霉素與GBE進行比較，探究GBE抗炎的作用機制及效果，并通過觀察GBE對慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）大鼠模型血清和肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）中白細胞介素1（Interleukin-1，IL-1）、白細 胞介素8（Interleukin-8，IL-8）含量的影響，研究其對COPD大鼠氣道及全身炎癥反應的干預作用，為臨床提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康清潔級7周齡雄性Wistar大鼠（廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK20090002）90只，稱重后隨機分為正常對照組（A組）、COPD對照組（B組）、GBE早期干預組（C組）、GBE后期干預組（D組）、紅霉素早期干預組（E組）、紅霉素后期干預組（F組），每組15只。對實驗大鼠進行稱重，A、B、 C、D、E、F 組分別為（270.50±14.42）、（234.89±17.00）、（239.06±15.52）、（234.94±11.53）、（248.50±20.97）和（239.81±15.50）g。

1.2 實驗試劑和器械

脂多糖（Lipopolysaccharid e，LPS）（美國Sigma公司），過濾嘴香煙（南寧卷煙廠生產真龍牌香煙，焦油含量19.0 mg，尼古丁1.2 mg），有機玻璃密閉箱（規(guī)格：80 cm×60 cm×50 cm，上方有一直徑1.2 cm的通氣孔），IL-1、IL-8檢測試劑盒（美國TSZ Biological Trade Co公司），舒血寧注射液（石家莊神威藥業(yè)有限責任公司，規(guī)格5 ml/支，含GBE 17.5 mg/支，總黃酮醇苷4.2 mg/支，銀杏內酯0.7 mg/支）主要成分為GBE。注射用乳糖酸紅霉素30萬u/瓶（大連美羅大藥廠生產，國藥準字H21021227）。

1.3 動物模型的復制

參照朱慧志等[1]的模型復制方法，采用煙霧吸入、LPS氣管內注入、冷空氣刺激復合因素復制COPD大鼠模型。A組于第1天和第14天氣管內注入2 ml/kg生理鹽水。B、C、D、E、F組在模型復制的第1天和第14天，將大鼠用10%水合氯醛，按照100 g/0.25 ml腹腔注射麻醉后，向大鼠氣管內注入100μ LPS（1 mg/ml）。第2～13天和15～28天，在有機玻璃密閉箱持續(xù)吸入點燃的香煙霧30min/次，1次/天，香煙用量15支/d，熏煙后立刻將大鼠移至15℃低溫環(huán)境，冷空氣刺激1 h，模型復制28 d結束。于第28天，B、C、D、E、F組各處死2只大鼠，取大鼠肺組織做病理切片，光學顯微鏡下觀察肺組織改變符合COPD表現。

1.4 給藥方法

1.4.1 早期給藥實驗第1～14天，C組用GBE干預；E組用紅霉素干預；A、B、D、F組用生理鹽水對照。

1.4.2 后期給藥實驗第29～42天，D組用GBE

干預；F組用紅霉素干預；A、B、C、E組用生理鹽水對照。

1.4.3 用藥量C、D 組 GBE 用藥量為 0.4 ml/（kg·d）（按照成人標準量0.29 ml/㎏，采用體表面積比值法：大鼠用藥量=成人量×70/56）；E、F組紅霉素用藥量根據體表面積換算方法為100 mg/kg2；A、B組用生理鹽水（1 ml/只，1次/d）對照。采用腹腔注射給藥。

1.5 觀察指標

1.5.1 血清IL-1、IL-8的檢測第43天，各組大鼠麻醉后從右心室取血3 ml，采用酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測血清中IL-1、IL-8的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.2 BALF中IL-1、IL-8的檢測第43天，各組大鼠麻醉及右心室取血后，行左側支氣管肺泡灌洗，每只大鼠收集肺泡灌洗5 ml，采用ELISA檢測BALF中IL-1、IL-8的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（±s）表示，用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清中IL-1、IL-8含量比較

2.1.1 IL-1各組大鼠血清中IL-1含量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），早期和后期使用GBE、紅霉素均能降低大鼠血清中IL-1的含量。A組與C、D、E組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；B組與A、C、D、E、F組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），B組血清中IL-1含量高于其他組；C組與D、E、F組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），C組血清中IL-1含量低于D、E、F組；C、D、E、F組兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.1.2 IL-8各組大鼠血清中IL-8含量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。A組與D組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；A組與B、C、E、F組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；B組與A、C、D、E、F 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；C、D、E、F組均能不同程度降低大鼠血清中IL-8含量，C、D、E、F組兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠BALF中IL-1、IL-8含量比較

2.2.1 IL-1各組大鼠BALF中IL-1含量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），早期和后期使用GBE、紅霉素均能降低大鼠BALF中IL-1的含量。A組與C、D、E、F組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；B組與A、C、D、E、F組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），B組BALF中IL-1含量高于其他組；C、D、E、F組兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.1.2 IL-8各組大鼠BALF中IL-8含量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。D組與A、B、C、E、F組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；A、B、C、E、F組兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 各組大鼠血清中IL-1、IL-8含量比較（n =13，pg/ml，±s）

表1 各組大鼠血清中IL-1、IL-8含量比較（n =13，pg/ml，±s）

A組 63.58±29.42 74.10±11.63 B組 116.47±29.92 137.91±26.98 C組 68.34±38.08 87.21±8.56 D組 76.61±41.02 85.82±11.58 E組 78.70±18.36 90.73±15.49 F 組 90.01±30.49 93.57±11.42 F值 4.248 24.420

表2 各組大鼠BALF中IL-1、IL-8含量比較（n =13，pg/ml，±s）

表2 各組大鼠BALF中IL-1、IL-8含量比較（n =13，pg/ml，±s）

A 組 38.72±16.83 38.35±4.22 B組 83.36±28.66 34.62±7.63 C組 38.80±15.33 39.40±5.86 D 組 33.98±9.21 29.25±5.24 E組 47.29±18.39 36.23±8.00 F 組 38.99±13.68 34.00±2.99 F值 12.495 4.487

3 討論

COPD的發(fā)病機制尚不完全明了，目前大多認為COPD為慢性持續(xù)性炎癥性氣道疾病，可累及各級支氣管和肺實質。巨噬細胞、中性粒細胞、上皮細胞等是COPD炎癥的主要參與細胞，釋放的炎癥因子，如IL-1β、IL-8等，對氣道結構細胞和促進中性粒細胞炎癥反應均產生重要影響[2]。IL-1主要由單核-巨噬細胞產生，也能由中性粒細胞合成，多存在于血液和組織中，分為膜結合型（IL-1α）和可溶型（IL-1β）2種。其中IL-1β可以激發(fā)靶細胞內NF-kB和MAPKKKs信號通路，誘導IL-8及其他炎癥因子釋放，并通過正反饋作用使炎癥效應不斷放大?？梢哉J為，IL-1β與IL-8處于同一反應鏈中，在COPD的病情發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。IL-8是目前公認的中性粒細胞趨化因子，主要由單核巨噬細胞產生，能促使中性粒細胞活化和遷移、釋放炎癥介質，直接損害組織[4]。

研究表明，使用小劑量紅霉素治療穩(wěn)定期COPD患者，痰中炎癥細胞總數，以及中性粒細胞的數量和比例明顯減少，痰和血清中的中性粒細胞濃度明顯降低，中性粒細胞的趨化性下降[5]。本研究發(fā)現，使用小劑量紅霉素能降低COPD大鼠血清及BALF中IL-1、IL-8的含量，從而有效抑制COPD的氣道炎癥反應。有報道稱，GBE可以降低血清及BALF中CRP的表達，可抑制氣道炎癥反應，提示GBE具有抑制COPD氣道炎癥及全身炎癥反應的作用[6]。本研究結果表明，GBE可降低COPD大鼠血清及BALF中IL-1、IL-8的含量，且與紅霉素無差異。進一步證實GBE具有抑制COPD氣道炎癥反應的作用，為GBE治療COPD提供新的實驗依據。

GBE是從銀杏葉中提取的化合物，目前被證實的發(fā)揮獨特藥理活性的有效成分主要有黃酮類、萜內酯類化合物，具有清除自由基、抗炎、抑制血小板聚集等作用[7]。臨床上，GBE廣泛應用于治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛、腦梗死、癡呆癥、糖尿病腎病等疾病，而有關GBE治療COPD的臨床報導較少。本研究發(fā)現，GBE能降低COPD大鼠血清及BALF中IL-1、IL-8的含量，從而發(fā)揮抑制COPD氣道及全身炎癥反應的作用，希望為臨床應用GBE提供一定的實驗理論依據。

[1]朱慧志, 韓明向, 丁小娟, 等. 多因素慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立[J]. 中國臨床保健雜志, 2005, 8: 145-146.

[2]中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組. 慢性阻塞性肺疾病診治指南[J]. 中華結核和呼吸雜志, 2007, 30(1): 8-17.

[3]曾建紅, 黃健瑩, 曾軍, 等. COPD患者治療前后血液細胞因子變化的檢測與意義[J]. 臨床肺科雜志, 2013, 18(8): 1403-1404.

[4]KRüGER S, WELTE T, EWIG S, et al. Biomarkers in community acquired pneumonia[J]. Ame J Res Cri Care Med, 2011, 183(12):1734-1735.

[5]歐莉梅, 鐘小寧, 何志義, 等. 小劑量紅霉素治療穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病臨床效果的研究[J]. 中國實用內科雜志, 2010,30(12): 1097-1100.

[6]張華玲, 譚玉萍, 李可成, 等. 銀杏葉提取物對慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥反應的影響[J]. 廣西中醫(yī)藥大學學報, 2012, 15(4):40-44.

[7]劉秀萍, 臧恒昌, 于洪利. 銀杏葉提取物的研究進展與應用前景[J]. 藥學研究, 2014, 12: 721-723.