杜晶　汪珊　黃傳輝

【摘 要】目的：優(yōu)化胃蛋白酶提取魚腥草多糖的制備工藝。方法 以多糖含量和多糖得率為指標(biāo)，才用正交試驗對胃蛋白酶提取魚腥草多糖的工藝進行優(yōu)化。結(jié)果及結(jié)論：最佳工藝條件為溫度50℃，pH=7，酶加入量5.0%，提取時間1.5h。魚腥草為三白草科 Saururaceae 蕺菜屬植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb的新鮮全草，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效，主要用于肺膿瘍、痰熱咳嗽、熱痢熱淋、癰瘡腫毒[1]。其水溶性多糖對羥自由基和超氧自由基有較明顯的清除作用[2]。但目前胃蛋白酶提取魚腥草多糖的工藝尚未報道，因此本實驗以多糖的率及含量為指標(biāo)[3]，采用正交試驗對魚腥草多糖提取工藝進行優(yōu)化。

【中圖分類號】R284.2 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）01--01

1 儀器與試藥

UV-2450紫外分光光度計（日本島津公司）；SHB3循環(huán)水真空泵（上海申生科技有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廣州市深華生物技術(shù)有限公司）；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空機（鞏義市英峪予華有限公司）；恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市宏華試劑廠）；GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、AY120電子天平（日本島津）。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（sigma公司）；胃蛋白酶（1：3000，批號081110 廣州市齊云生物生產(chǎn)）；苯酚、濃硫酸、氨水、95%乙醇均為分析純，苯酚試液（自配[4]）

干品魚腥草購于廣州清平市場，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥鑒定教研室姬生國博士鑒定為三白草科蕺菜屬植物Houttuynia cordata Thunb.。

2 方法與結(jié)果

2.1 魚腥草多糖的提取 稱取魚腥草藥材5.0g，按正交設(shè)計表條件進行提取，按照正交實驗表進行試驗，提取液濃縮至1：4（原料重：溶液體積），80%乙醇醇沉，靜置2小時以上，抽濾，取沉淀，50度烘箱里烘干，得粗多糖[5]。

2.2 魚腥草多糖含量測定方法的建立

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.0994g ，加水溶解并定容至 100mL，移取1ml，加水定容至10ml容量瓶中，即得濃度為0.0994mg/mL的葡萄糖對照品貯備液。

2.2.2 供試液的制備：稱取魚腥草藥材5.2g，按照正交設(shè)計表進行提取，得粗多糖。精密稱取于50℃烘干至衡重的粗多糖100mg，加水溶解并定容至50ml，搖勻，再取1mL定容至10mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精稱葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，置10mL容量瓶中加水至刻度線，搖勻，再分別取1mL，加適量苯酚溶液及濃硫酸顯色45min。置分光光度計中，于490nm測定吸收度，以吸收度（A）對葡萄糖含量（C）進行回歸，得回歸方程：A=8.4286C-0.0258 ，相關(guān)系數(shù)γ=0.9969。結(jié)果表明葡萄糖在0.0192～0.0596mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 多糖含量的測定：取供試品溶液1mL，置于試管中，加適量苯酚及濃硫酸，振搖均勻，顯色45min。另取1mL 蒸餾水 ，加同量苯酚和濃硫酸 ，同法操作 ，作為空白對照。置UV-2450型分光光度計中 ，于490nm測定吸收度。

2.2.5 多糖提取得率：稱取魚腥草藥材5.2g，按正交試驗表進行提取，得粗多糖。多糖得率=100%*（粗多糖的量/藥材的量）。

2.2.6 蛋白質(zhì)含量的測定：稱取魚腥草藥材5.2g，按正交設(shè)計表進行提取，得粗多糖。精密稱取于50℃烘干至衡重的粗多糖0.1000g，加水溶解并定容至50mL，搖勻。以蒸餾水為空白對照，于分光光度計中測定280nm、260nm處吸收度。根據(jù)公式求出蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45D280-0.74D260[6]

2.3 胃蛋白酶提取最佳條件優(yōu)選 影響酶法提取多糖的因素主要有酶添加量、pH值、溫度、時間等[7]，在單因素實驗的基礎(chǔ)上以pH=7，以40倍魚腥草藥材體積水提取多糖，對酶添加量、溫度、時間等因素采用L9（34）正交試驗法確定胃蛋白酶最佳提取條件。最佳提取條件要滿足多糖提取率高級含量高，因此我們采用加權(quán)評分法綜合評價魚腥草多糖的提取條件。評分標(biāo)準(zhǔn)為：將各項指標(biāo)除以該列最大值再乘以100，通過處理，多糖的率和多糖含量都在0至100之間。根據(jù)多糖得率（x）和多糖含量（y）的作用，而確定二者的權(quán)重系數(shù)分別為0.4、0.6對兩項指標(biāo)得分的加權(quán)求和，通過公式z=0.4x+0.6y，得到綜合評分（z）.由正交試驗及方差結(jié)果表明，胃蛋白酶提取多糖的影響因素大小順序為：A>C>B，最佳提取條件為：A3B3C3，即ph=7，溫度50℃，酶加入量5.0%，提取時間1.5h。

2.4 驗證試驗 按胰蛋白酶5.0%，40倍體積在pH=7，50℃溫浸1.5小時的方法提取三次，進行重復(fù)試驗。魚腥草多糖得率分別為9.52%、9.90%、9.60%，RSD%=0.20。魚腥草多糖含量分別為20.41%、22.45%、20.79%，RSD%=1.08%。表明重現(xiàn)性良好。

3 討論

本實驗采用單因素試驗和正交試驗相結(jié)合，最終確定了胃蛋白酶最佳提取魚腥草多糖的工藝條件為以40倍藥材體積水，在pH=7，溫度50℃，酶加入量5.0%，提取時間1.5h。該工藝既保證了得率還提高了含量，為魚腥草進一步研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻

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嵇文亞，孟 江. 堿法提取魚腥草多糖的工藝研究[J].齊魯藥事，2008，27（1）：44～46.

余世春，徐金龍，汪海孫，等.苯酚-硫酸法測定小柴胡湯口服液多糖的含量[J].中成藥，1993，15：12.

劉淑蕊等.基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對木瓜蛋白酶法提取魚腥草多糖工藝的優(yōu)化[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2013，29（2）：130～133

蔡武城，衰厚積主編.生化物質(zhì)常用化學(xué)分析法[M].科學(xué)出版社，1982.98

孫向軍.螺旋藻多糖提取新工藝的研究[J].食品科學(xué)，2000（2）：32～34.endprint