李雅悅+李廣誠+朱宏+梁梅亭+薩依臘西

摘要：目的 觀察針刺對阿爾茨海默?。ˋD）模型小鼠行為學(xué)，大腦海馬神經(jīng)元線粒體分裂蛋白1（Fis1）、線粒體融合蛋白1（OPA1）表達(dá)及線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響，探討針刺治療AD的作用機制。方法 40只雄性SAMP8小鼠隨機分為針刺組和模型組，每組20只。另取20只同月齡雄性正常老化模型小鼠（SAMR1小鼠）作為正常組，針刺組選取“腎俞”“百會”“血?！薄半跤帷边M(jìn)行干預(yù)。8周后，Morris水迷宮實驗檢測小鼠行為學(xué)，之后提取海馬組織，Western blot檢測小鼠海馬線粒體相關(guān)蛋白Fis1和OPA1的表達(dá)，電鏡觀察小鼠海馬神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 與模型組比較，針刺組逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），其停留在原平臺象限時間延長和穿越原平臺次數(shù)明顯增加（P<0.05）；針刺組Fis1表達(dá)明顯減弱，OPA1表達(dá)明顯增強（P<0.05，P<0.01）；針刺組線粒體超微結(jié)構(gòu)明顯改善，線粒體體密度及面密度明顯增加（P<0.05）。結(jié)論 針刺可能通過提高模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、下調(diào)Fis1表達(dá)、上調(diào)OPA1表達(dá)和改善線粒體超微結(jié)構(gòu)，達(dá)到治療AD的作用。

關(guān)鍵詞：針刺；阿爾茨海默??；Morris水迷宮；線粒體分裂蛋白1；線粒體融合蛋白1；超微結(jié)構(gòu)；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.014

中圖分類號：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）02-0059-06

Effects of Acupuncture on Behaviors， Expressions of Fis1 and OPA1， and Mitochondrial Ultrastructure of Mice Model of Alzheimer Disease

LI Ya-yue， LI Guang-cheng， ZHU Hong， LIANG Mei-ting， Sayilaxi

The Third Xiangya Hospital of Central South University， Changsha 410013， China

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture on the behaviors and the expressions of Fis1 and OPA1， as well as mitochondrial ultrastructure in the hippocampus of mice with Alzheimer disease （AD）； To explore the mechanism of action of acupuncture for AD. Methods Forty male SAMP8 mice were randomly divided into acupuncture group and model group， with 20 mice in each group. Another 20 male natural aging mice with the same age （SAMR1 mice） were set as the normal group. Acupuncture group chose Shenshu， Baihui， Xuehai and Geshu for intervention. 8 weeks later， Morris water maze was used to test the mice behaviors， and then hippocampus organization was taken. Western blot was used to detect the expressions of Fis1 and OPA1 and mitochondrial ultrastructure in hippocampal neurons of mice was observed by transmission electron microscopy. Results Compared with the model group， the escape latency of acupuncture group was significantly shortened （P<0.05）， and the stay time in the former platform quadrant and former platform crossing times were significantly increased （P<0.05）. The expression of Fis1 in the hippocampus of acupuncture group decreased significantly （P<0.05）， while the expression of OPA1 increased significantly （P<0.05）. The mitochondrial ultrastructure in hippocampus in the acupuncture group was effectively improved， and the mitochondrial surface density and body density were both increased in the acupuncture group compared with the model group （P<0.05）. Conclusion Acupuncture may play a potential therapeutic role in AD by decreasing the expression of Fis1， increasing the expression of OPA1， recovering the injury of mitochondrial ultrastructure.endprint

Keywords： acupuncture； Alzheimer disease； Morris water maze； Fis1； OPA1； mitochondrial ultrastructure； mice

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種慢性進(jìn)行性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，臨床表現(xiàn)以近期記憶減退、語言功能障礙、認(rèn)知功能障礙、自主生活能力下降，人格和行為的改變?yōu)橹饕卣鱗1]。大量研究表明，線粒體動力學(xué)異常（分裂增加、融合減少）及形態(tài)結(jié)構(gòu)異常在AD發(fā)病早期扮演著重要角色[2-3]，在AD患者和動物模型神經(jīng)元細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)線粒體動力學(xué)異常的改變。

針刺是AD治療的一個重要手段，前期研究表明，針刺能夠改善AD患者的認(rèn)知功能[4]，改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[5]，針刺能上調(diào)SAMP8小鼠海馬組織腦紅蛋白的表達(dá)，其治療作用機制可能涉及激發(fā)內(nèi)源性抗氧化體系，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[6]，可明顯降低SAMP8小鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性，改善膽堿能系統(tǒng)的功能[7]。針刺還能上調(diào)中性內(nèi)肽酶（NEP）的表達(dá)來促進(jìn)β-淀粉樣蛋白（Aβ）的降解，減少Aβ的沉積，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8]。我們還研究了針刺對SAMP8小鼠海馬蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)的影響，鑒定出線粒體烏頭酸水合酶、細(xì)胞色素C氧化酶[9]以及腦紅蛋白等多種與氧化應(yīng)激相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，而線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧自由基的主要來源，這說明線粒體可能是針刺發(fā)揮治療作用的主要“亞細(xì)胞器靶點”。本研究立足于SAMP8小鼠行為學(xué)改變、線粒體動力學(xué)異常及超微結(jié)構(gòu)改變在AD發(fā)病中的重要作用，以AD模型小鼠為研究對象，采用Morris水迷宮實驗檢測小鼠行為學(xué)，Western blot檢測線粒體分裂蛋白1（Fis1）和線粒體融合蛋白1（OPA1）表達(dá)，電鏡觀察AD模型小鼠海馬神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)，從SAMP8小鼠行為學(xué)改變、線粒體動力學(xué)及超微結(jié)構(gòu)闡述針刺治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

6月齡雄性SAMP8小鼠40只，6月齡雄性SAMR1小鼠20只，均購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗中心，動物質(zhì)量合格證號0004582，小鼠體質(zhì)量（25±3.5）g，均為清潔級動物，飼養(yǎng)于墊鋸木屑的飼料籠中，自由攝食飲水，溫度18～22 ℃、相對濕度40%～50%，光照充足和通風(fēng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將SAMP8小鼠按隨機數(shù)字表分為針刺組、模型組，每組20只，另取雄性SAMR1小鼠作為正常組。本實驗經(jīng)中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號LLSC（LA）2014-030]。實驗過程中操作按照國家科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

一抗Fis1兔抗試劑盒（美國Proteintech Group公司），一抗OPA1兔抗試劑盒（美國Proteintech Group公司），復(fù)合二抗試劑盒（HRP-Polymer anti ms/rbIgG，邁新公司），Bradford蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）。透射式電子顯微鏡（日本日立公司，型號H-600），超薄切片機（瑞典BROMMA公司，LKB-V型），低溫冰箱（BCD-256KFB），華佗牌針灸針（0.25 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠），Morris水迷宮（中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院）。

1.3 干預(yù)

針刺組選取“百會”“血?！薄澳I俞”“膈俞”，“百會”向后平刺3～5 mm，“血?！薄澳I俞”直刺2～3 mm，“膈俞”以80°角斜向上刺2～3 mm，其中“血?！薄澳I俞”“膈俞”先刺激左側(cè)穴位，次日再刺激右側(cè)，交替進(jìn)行。小鼠穴位定位以及針刺深度參照國家十五規(guī)劃教材《實驗針灸學(xué)》中“動物針灸穴位圖譜”[10]及相關(guān)文獻(xiàn)[11]。進(jìn)針后，補瀉手法參考針刺手法量學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[12]：“血?！薄半跤帷笔┠磙D(zhuǎn)瀉法，施針幅度180～360°，頻率50～60次/min；“腎俞”“百會”施捻轉(zhuǎn)補法，施針幅度60～90°，頻率120～150次/min，運針1 min，留針10 min。模型組和正常組小鼠進(jìn)行與上述相同時間程度的捉抓刺激。每日處理1次，第7日暫停1次，連續(xù)干預(yù)8周。

1.4 行為學(xué)測試

針刺結(jié)束后，Morris水迷宮實驗檢測小鼠行為學(xué)。前4 d為隱蔽平臺實驗，最后1 d進(jìn)行空間探索實驗。Morris水迷宮由4個象限組成，直徑160 cm，水深40 cm。平臺直徑15 cm，位于象限Ⅰ中心，隱匿于水下2 cm，水溫保持25～27 ℃。在4個象限池壁中點做標(biāo)記，作為小鼠的入水點。測試時，將小鼠面向池壁，分別從4個入水點放入水池，記錄小鼠從入水到找到平臺所需的時間，即逃避潛伏期。小鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立20 s。若60 s內(nèi)小鼠未找到平臺，則將其從水中引導(dǎo)到平臺上并停留20 s，并將該次成績記為60 s，然后進(jìn)行下一象限訓(xùn)練。每只小鼠從4個入水點分別放入水池為1次訓(xùn)練，每日訓(xùn)練1次，連續(xù)4 d。第5日時，進(jìn)行空間探索實驗，撤去平臺，每只小鼠從象限Ⅲ入水點放入水池，記錄其在60 s內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)及在原平臺所在象限游泳的時間占總時間的百分比。

1.5 Western blot檢測

針刺干預(yù)8周后，將每組中15只小鼠斷頭處死，無菌條件下冰臺上分離海馬組織，剪取約0.5 mg組織，置于組織勻漿器中，加入1 mL總蛋白提取液，勻漿5～20 min充分破碎，置于冰上10～20 min后，再勻漿5～20 min，將勻漿液吸出，置于1.5 mL離心管。Bradford法測定蛋白質(zhì)含量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，加入一抗，室溫下于搖床孵育2 h，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，化學(xué)發(fā)光，得到膠片。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。endprint

1.6 超微結(jié)構(gòu)觀察

針刺干預(yù)8周后，各組剩余小鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）處理至深度麻醉，開胸暴露并游離出心臟，灌注滿意后，斷頸取腦，分離出的腦組織海馬標(biāo)本快速放入2.5%戊二醛中固定，置于4 ℃冰箱保存2 h以上；0.1 mol/L PBS漂洗3次×10 min過夜；1%鋨酸固定1.5 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次×10 min；不同梯度乙醇脫水2次，每次15 min；純丙酮脫水2次，每次15 min；環(huán)氧樹脂812∶丙酮（1∶1）浸透30 min，純包埋液浸透1 h，純包埋液固化37 ℃、24 h后60 ℃、48 h；切片，鈾、鉛染色；透射電鏡觀察，拍片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析，方差齊用LSD或SNK檢驗，方差不齊用秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P<0.01），穿越平臺次數(shù)減少、停留原平臺象限時間縮短；與模型組比較，針刺組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），穿越平臺次數(shù)增加、停留原平臺象限時間延長。結(jié)果見圖1、表1和表2。

2.2 Western blot結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠海馬線粒體Fis1表達(dá)明顯升高、OPA1表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，針刺組小鼠Fis1表達(dá)明顯降低、OPA1表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表3、圖2和圖3。

2.3 線粒體超微結(jié)構(gòu)變化

正常組小鼠海馬線粒體呈圓形或桿狀，大小正常，數(shù)目較多，分布密集，結(jié)構(gòu)清晰，嵴清晰且排列整齊，基質(zhì)均勻一致，線粒體未出現(xiàn)腫脹及空泡變性；模型組小鼠海馬線粒體變大變圓，數(shù)目較少，且分布不均，嵴大部分排列不規(guī)則，部分可見內(nèi)嵴斷裂變短變少，基質(zhì)變淺，部分線粒體出現(xiàn)腫脹且空泡變性；針灸組小鼠海馬線粒體形態(tài)呈卵圓形，體積大小相對均勻，數(shù)目可，且分布較均勻，嵴尚清晰且排列尚可，少數(shù)可見嵴內(nèi)腔輕微擴張及內(nèi)嵴輕度溶解，多數(shù)基質(zhì)尚均勻，少數(shù)可見基質(zhì)變淺，僅見部分線粒體輕度腫脹，無明顯空泡變性。海馬神經(jīng)元線粒體體視學(xué)分析結(jié)果示：與正常組比較，模型組小鼠線粒體體密度和面密度變?。≒<0.01）；與模型組比較，針刺組線粒體體密度和面密度變大（P<0.05）。結(jié)果見圖4、表4。

3 討論

Morris水迷宮行為學(xué)測試是研究癡呆動物行為學(xué)的經(jīng)典方法。其中隱蔽平臺實驗?zāi)芊从硠游飳W(xué)習(xí)能力，而空間探索實驗則反映其記憶能力。一般將逃避潛伏期、穿越原平臺次數(shù)及在原平臺所在象限游泳時間占總時間的百分比作為評價小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的客觀指標(biāo)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)針刺可以縮短SAMP8逃避潛伏期，并增加其穿越原平臺次數(shù)、延長在原平臺所在象限停留時間。表明針刺可通過提高SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，從而達(dá)到防治癡呆的目的。

線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變在AD發(fā)生發(fā)展的過程中起著重要作用。在AD患者及動物腦組織中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞線粒體存在普遍的形態(tài)學(xué)改變，主要表現(xiàn)在線粒體呈現(xiàn)片段化趨勢，大小不均，參差不齊，差異巨大，平均體積縮小，嵴變短、較少或消失，線粒體膜流動性降低，線粒體數(shù)目減少等[9，13-14]。線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)異常是線粒體功能異常的物質(zhì)基礎(chǔ)[15]，而線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的主導(dǎo)因素是線粒體動力學(xué)。在活的細(xì)胞中，運用熒光標(biāo)記技術(shù)可以看到線粒體是一種處于高度運動狀態(tài)的細(xì)胞器，實時動態(tài)觀測可發(fā)現(xiàn)線粒體呈蛇樣扭動，頻繁出現(xiàn)分裂和融合。而靜態(tài)技術(shù)記錄到的線粒體形態(tài)實際上是這種分裂和融合動態(tài)平衡的瞬間結(jié)果，線粒體分裂和融合的動態(tài)過程被稱為線粒體動力學(xué)。線粒體分裂和融合之間的動態(tài)平衡對線粒體結(jié)構(gòu)的完整性及其正常功能的發(fā)揮起著極為關(guān)鍵的作用，它們分別接受線粒體分裂蛋白及線粒體融合蛋白的調(diào)控，調(diào)控分裂的蛋白主要包括動力素相關(guān)蛋白1（Drp1）和Fis1蛋白，而調(diào)控融合蛋白主要包括OPA1、線融素1（Mfn1）和線融素2（Mfn2）[16]。許多研究表明，與年齡匹配的對照組比較，AD患者腦內(nèi)線粒體融合蛋白OPA1、Mfn1和Mfn2表達(dá)降低，而線粒體分裂蛋白Drp1和Fis1則表達(dá)升高，并且結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)改變隨著AD病情進(jìn)展而增加[17-19]。這表明在AD中線粒體分裂占據(jù)優(yōu)勢，線粒體分裂/融合平衡機制的打破為AD病理進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

位于線粒體外膜上的Fis1功能是將細(xì)胞質(zhì)中的 Drp1 招募至外膜上組裝[20]。之后共同聚集于線粒體潛在的分裂位點[21]。線粒體分裂后，Drp1又重新回到胞漿，再參與下一輪線粒體的分裂，如此循環(huán)往復(fù)。當(dāng)Fis1增多或清除減慢時，就會促使線粒體裂解增強，誘導(dǎo)線粒體碎片化。Fis1缺失突變的細(xì)胞中，Drp-1多定位于胞漿，線粒體分裂受到抑制，表明Fis1是調(diào)節(jié)線粒體分裂裝置的重要分子[22]。有研究表明，AD患者尸檢海馬組織Fis1的表達(dá)水平明顯升高[23]。Eckert G P等[24]在研究中發(fā)現(xiàn)快速老化小鼠海馬Fis1表達(dá)明顯比正常老化小鼠高。本研究中，Western blot結(jié)果顯示，針刺可下調(diào)快速老化小鼠Fis1水平，表明針刺可通過降低分裂蛋白過度表達(dá)，減少線粒體的損害，從而達(dá)到保護(hù)線粒體功能的目的。

OPA1屬發(fā)動蛋白家族，定位于線粒體內(nèi)外膜間隙中，主要促進(jìn)線粒體內(nèi)膜的融合[25]。OPA1對維持嵴的形態(tài)、保護(hù)和穩(wěn)定線粒體的結(jié)構(gòu)、維持呼吸鏈的完整具有重要作用，同時還能減輕線粒體的結(jié)構(gòu)破壞和調(diào)亡因子細(xì)胞色素C的釋放而抑制細(xì)胞調(diào)亡[26]。因此，OPA1的缺失或突變可導(dǎo)致線粒體嵴間隙變寬，影響嵴重構(gòu)，還可導(dǎo)致線粒體的碎片化或線粒體融合受阻[27]。有研究顯示，AD患者海馬組織OPA1的表達(dá)水平明顯降低[28]。Palomera-avalos V等[29]在研究中發(fā)現(xiàn)，SAMP8小鼠海馬OPA1表達(dá)比正常小鼠明顯降低。本研究中Western blot結(jié)果顯示，針刺可上調(diào)快速老化小鼠OPA1水平。表明針刺可通過促進(jìn)融合蛋白的表達(dá)，改善線粒體動力學(xué)異常，從而達(dá)到保護(hù)線粒體功能的目的。endprint

經(jīng)針刺治療后，透視電鏡下可見海馬線粒體形態(tài)呈卵圓形，體積大小相對均勻，數(shù)目可，且分布較均勻，嵴尚清晰且排列尚可，少數(shù)可見嵴內(nèi)腔輕微擴張及內(nèi)嵴輕度溶解，多數(shù)基質(zhì)尚均勻，少數(shù)可見基質(zhì)變淺，僅見部分線粒體輕度腫脹，無明顯空泡變性，較模型組明顯好轉(zhuǎn)。表明針刺可以通過改善線粒體超微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)線粒體形態(tài)大小正常，使其在細(xì)胞中分布均勻整齊，并減輕嵴斷裂及線粒體腫脹等機制來發(fā)揮其對線粒體超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，從而促進(jìn)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的正常。

腎虛精虧髓減是AD的發(fā)病根本，五臟失調(diào)及血瘀痰阻等是AD的發(fā)病關(guān)鍵。腎虛為病，易產(chǎn)生因虛致瘀的病理改變，血瘀是腎虛衰老的病理產(chǎn)物，也是加速腎虛衰老的重要病因，故腎虛血瘀?；橐蚬１狙芯咳　鞍贂薄把！薄澳I俞”“膈俞”，正是取其補腎活血之治法，其中百會為頭之巔頂，手足三陽經(jīng)及督脈的陽氣在此交會，故刺激百會有補腎通腦、調(diào)腎醒腦、開竅益智之功；腎俞則為腎的背腧穴，具有益腎填髓充腦的功效；血海為治療血證要穴，可以行血化瘀、蠲化濕濁，膈俞為八會穴之血會，兩穴配合，活血化瘀、化痰蠲閉之效尤甚。以上諸穴，共奏補腎通腦、開竅益智、活血化瘀之效。

總之，針刺能夠有效縮短SAMP8小鼠逃避潛伏期，增加其穿越原平臺次數(shù)及在原平臺象限停留時間，下調(diào)SAMP8小鼠海馬線粒體Fis1的表達(dá)，上調(diào)OPA1的表達(dá)，有效提高SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，減少線粒體動力學(xué)異常，改善線粒體超微結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到防治AD的目的。

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