陳靜 張道偉 錢(qián)正敏

（1. 遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遵義 563000；2. 遵義師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遵義 563002）

幾丁質(zhì)是一種在真菌、甲殼動(dòng)物及節(jié)肢動(dòng)物中廣泛存在的多糖類(lèi)生物高分子，是昆蟲(chóng)氣管、表皮、圍食膜等組織的重要組成部分，在對(duì)昆蟲(chóng)內(nèi)部組織器官的保護(hù)和抵抗外源生物的侵染中發(fā)揮著非常重要的作用［1-3］。幾丁質(zhì)的合成和降解是昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的重要過(guò)程，所以也成為害蟲(chóng)控制的理想靶標(biāo)。幾丁質(zhì)對(duì)昆蟲(chóng)具有保護(hù)作用，但同時(shí)也限制了昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)，所以當(dāng)昆蟲(chóng)成長(zhǎng)到一定階段時(shí)，就需要蛻去舊表皮，合成更大的新表皮，以適應(yīng)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)。而新表皮的合成就是由幾丁質(zhì)合成酶（Chitin synthase，CHS）等酶系催化合成新的幾丁質(zhì)到新的表皮中。

CHS是幾丁質(zhì)合成的關(guān)鍵酶之一。理論分子量為160-180 kD，是糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員［4-5］。通過(guò)對(duì)不同種昆蟲(chóng)的CHS蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHS有3個(gè)相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域A、B、C。結(jié)構(gòu)域A位于CHS的N端，是一段跨膜螺旋結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)域B位于CHS的活性中心，含有2個(gè)保守的氨基酸組成EDR和QRRRW；結(jié)構(gòu)域C位于CHS的C端，包含一段相對(duì)保守的氨基酸序列和7個(gè)跨膜螺旋，這個(gè)區(qū)域被認(rèn)為參與對(duì)幾丁質(zhì)合成的調(diào)控。在大多數(shù)昆蟲(chóng)中存在兩個(gè)CHS：CHS1和CHS2，這兩個(gè)CHS被認(rèn)為參與不同組織器官的幾丁質(zhì)合成。其中，CHS1主要參與表皮和氣管中幾丁質(zhì)的合成，CHS2主要參與圍食膜中幾丁質(zhì)的合成。另外，有研究發(fā)現(xiàn)在岡比亞按蚊Anopheles gambiae的復(fù)眼中可以檢測(cè)到CHS1和CHS2基因的表達(dá)。赤擬谷盜中可以檢測(cè)到CHS1基因主要在卵和蛹期中表達(dá)［6-7］。對(duì)不同種昆蟲(chóng)中CHS基因的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)昆蟲(chóng)的CHS1基因存在一個(gè)可變剪接的外顯子，而CHS2基因中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可變剪接的現(xiàn)象。CHS基因的序列在多種昆蟲(chóng)中已被陸續(xù)獲得，如銅綠蠅（Lucilia cuprina）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、果蠅（Drosophila melanogaster）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、岡比亞按蚊（A.gambiae）等，但是還有待于更深層次的研究［8］。RNA干擾（RNAi，RNA interference）技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究中。利用RNAi技術(shù)研究CHS1基因?qū)|亞飛蝗（Locusta migratoria manilensis）生長(zhǎng)發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默CHS1的可變外顯子a會(huì)導(dǎo)致東亞飛蝗發(fā)育遲緩，蛻皮障礙，而沉默CHS1的可變外顯子b會(huì)引起腿部畸形［9］。

白背飛虱隸屬同翅目飛虱科，是危害我國(guó)水稻正常生長(zhǎng)的主要害蟲(chóng)之一［10］。白背飛虱除了自身刺吸水稻汁液外，還會(huì)傳播水稻病毒，給水稻的生產(chǎn)帶來(lái)毀滅性的災(zāi)難［11-12］。本研究基于白背飛虱的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得了白背飛虱CHS1基因的全長(zhǎng)序列，對(duì)該基因序列的兩個(gè)可變外顯子進(jìn)行了分析并探究了白背飛虱中CHS1基因在各齡期發(fā)育階段及各組織器官中的表達(dá)水平。通過(guò)顯微注射的方法對(duì)白背飛虱的CHS1基因進(jìn)行了RNAi實(shí)驗(yàn)。通過(guò)上述研究，旨為闡明CHS1基因在白背飛虱中的生理作用，為利用CHS1基因治理白背飛虱奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 白背飛虱由本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)于人工氣候室無(wú)任何處理的水稻上。飼養(yǎng)條件：（27±1）℃，相對(duì)濕度70%，光周期16L∶8D。

1.1.2 試劑 PCR相關(guān)試劑，反轉(zhuǎn)錄RT-PCR相關(guān)試劑，熒光定量PCR相關(guān)試劑，克隆載體pMD-18T，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker均購(gòu)自TAKARA公司；動(dòng)物RNA提取試劑盒，膠回收試劑盒、質(zhì)?；厥赵噭┖匈?gòu)自北京天根公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自北京全式金公司；dsRNA合成試劑盒T7 RiboMax Express RNAi System購(gòu)自Promega公司；引物合成及序列測(cè)定由上海生工公司完成，其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 白背飛虱CHS1基因的獲得 通過(guò)對(duì)本課題組前期獲得的白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，得到白背飛虱CHS1基因。根據(jù)這段序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增的驗(yàn)證引物SfCHS1-F和SfCHS1-R（引物序列見(jiàn)表1）。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，菌落PCR鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 白背飛虱CHS1基因可變剪接的驗(yàn)證 根據(jù)已有研究報(bào)道，昆蟲(chóng)CHS1基因存在可變剪接現(xiàn)象，所以我們對(duì)比了不同昆蟲(chóng)CHS1基因可變剪接出現(xiàn)的位置，在可變剪接位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)了引物SfCHS1-YZF和SfCHS1-YZR（表1）進(jìn)行驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，菌落PCR鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的引物

1.2.3 白背飛虱CHS1基因的時(shí)空表達(dá)特異性檢測(cè) 取4齡1-3 d，5齡1-3 d的白背飛虱若蟲(chóng)，羽化1 d和2 d的白背飛虱成蟲(chóng)，分別用RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)SfCHS1基因在白背飛虱4齡到成蟲(chóng)各蟲(chóng)期的表達(dá)情況。

取5齡1 d的白背飛虱若蟲(chóng)，CO2麻醉后于冰上解剖出表皮、氣管和腸。分別用RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)SfCHS1基因在白背飛虱表皮，氣管，腸中表達(dá)情況。用于檢測(cè)SfCHS1基因時(shí)空表達(dá)特異性的引物為：SfCHS1-YGF和SfCHS1-YGR（表1）。以白背飛虱β-actin基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)引物為β-actin-YGF和β-actin-YGR。熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR（2×）5 μL，cDNA 模板 1 μL，上、下游引物各 0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)條件為 ：95℃預(yù)變性10 s，95℃變性5 s，60℃延伸30 s，35

個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次測(cè)定。

1.2.4 顯微注射RNAi實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)用于合成SfCHS1基因dsRNA的引物SfCHS1-dsRNA-F和SfCHS1-dsRNA-R及陰性對(duì)照綠色熒光蛋白GFP基因的引物 GFP-dsRNA-F 和 GFP-dsRNA-R（ 表 1）， 按 照dsRNA合成試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行SfCHS1基因及GFP基因dsRNA的合成，用微量注射儀（Eppendorf公司）將dsRNA導(dǎo)入白背飛虱5齡1 d的若蟲(chóng)體內(nèi)（10 ng/頭，注射方法參照文獻(xiàn)［12］），以無(wú)關(guān)dsRNA-GFP作為對(duì)照，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)SfCHS1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 序列及數(shù)據(jù)分析 引物設(shè)計(jì)采用Primer 5軟件，測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，SfCHS1基因開(kāi)放閱讀框分析采用DNAstar軟件。氨基酸序列同源比對(duì)采用BLASTx程序，蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用MEGA 7.0 軟件，以Neighbor-joining算法進(jìn)行分析，蛋白分子量及等電點(diǎn)預(yù)測(cè)采用在線軟件（http://www.expasy.org），糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)采用在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）， 數(shù) 據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 白背飛虱CHS1基因的序列驗(yàn)證及分析

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析及全長(zhǎng)擴(kuò)增驗(yàn)證，獲得了白背飛虱SfCHS1基因全長(zhǎng)序列（GenBank登陸號(hào)：KY987034.1）。SfCHS1基因開(kāi)放閱讀框ORF長(zhǎng)4 719 bp，編碼1 572個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白的分子量為180.6 kD，等電點(diǎn)為6.72。預(yù)測(cè)有6個(gè)N-糖基 化 位 點(diǎn)（18-21：NFSD；425-428：NLTI；917-920：NISL；956-959：NWTS；1 289-1 292：NSSV；1 327-1 330：NISY），有16個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。根據(jù)已有研究報(bào)道，昆蟲(chóng)CHS1基因存在可變剪接現(xiàn)象，所以對(duì)比了不同昆蟲(chóng)CHS1基因可變剪接出現(xiàn)的位置，在可變剪接位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)了引物，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了白背飛虱幾丁質(zhì)合成酶1的兩個(gè)可變外顯子SfCHS1a和SfCHS1b，兩個(gè)外顯子區(qū)共有54個(gè)核苷酸和13個(gè)氨基酸的差異（圖1）。可變外顯子包含一個(gè)跨膜區(qū)段。

圖1 白背飛虱SfCHS1基因兩個(gè)可變外顯子的核苷酸和蛋白序列比對(duì)結(jié)果

2.2 白背飛虱CHS1基因的進(jìn)化樹(shù)分析

利用Mega 7軟件將白背飛虱CHS1基因的蛋白序列與其它昆蟲(chóng)的CHS1基因的蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)白背飛虱的CHS1基因與同為同翅目飛虱科的灰飛虱（L striatellus）及褐飛虱（N. lugens）的親緣關(guān)系最近，達(dá)到97%。這個(gè)結(jié)果與Vector NTI軟件分析出的白背飛虱CHS1蛋白序列與其他昆蟲(chóng)的CHS1蛋白序列比對(duì)的結(jié)果一致。

2.3 白背飛虱CHS1基因的時(shí)間表達(dá)特性

選取4齡1-3 d，5齡1-3 d，成蟲(chóng)1-2 d共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)SfCHS1基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)SfCHS1基因在4齡和5齡期的第1天，也即蛻皮完成后，合成新的表皮時(shí)表達(dá)量最高，在表皮合成后的幾天快速下降，在成蟲(chóng)期的第1天也會(huì)上升，而后逐漸下降。在4齡和5齡期的最后1 d，SfCHS1基因的表達(dá)量最低。

2.4 白背飛虱CHS1基因的組織表達(dá)特異性

選取5齡1 d的白背飛虱若蟲(chóng)解剖后進(jìn)行組織特異性表達(dá)檢測(cè)。定量PCR檢測(cè)結(jié)果（圖4）表明，白背飛虱的CHS1基因主要在表皮中大量表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量為25，其次為氣管，相對(duì)表達(dá)量為7.8，在腸中也有少量表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量為2.5。

圖2 CHS1蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

圖3 定量PCR檢測(cè)SfCHS1 mRNA發(fā)育表達(dá)模式

2.5 顯微注射RNAi后CHS1基因的表達(dá)分析

選取5齡1 d的白背飛虱若蟲(chóng)，用顯微注射儀將SfCHS1基因的dsRNA（10 ng/頭）導(dǎo)入白背飛虱體內(nèi)，在注射后的24 h和 48 h分別檢測(cè)SfCHS1基因的表達(dá)量。結(jié)果如圖5所示，在注射SfCHS1基因dsRNA后的24 h，即可檢測(cè)到SfCHS1基因的表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降，為對(duì)照組表達(dá)量的40%，注射48 h后，SfCHS1基因的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的9%，均存在極顯著差異（P＜0.01，t-test）。

圖4 SfCHS1基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.6 顯微注射RNAi后白背飛虱的存活率

選取5齡1 d的白背飛虱若蟲(chóng)，用顯微注射儀將SfCHS1基因及GFP基因的dsRNA（10 ng/頭）導(dǎo)入白背飛虱體內(nèi)（每組20頭蟲(chóng)，3組重復(fù)），在注射后的24 h、48 h、72 h、96 h分別統(tǒng)計(jì)白背飛虱的存活率。結(jié)果如圖6所示，CHS1基因干擾后對(duì)白背飛虱的存活率有極大的影響，注射48 h后，存活率與對(duì)照相比，有極顯著性差異（P＜0.01，t-test），為對(duì)照的0.6倍，注射72 h后，存活率為對(duì)照的0.3倍，注射96 h后，存活率為對(duì)照的0.13倍。

圖5 RNAi后SfCHS1基因的相對(duì)表達(dá)量

圖6 RNAi后白背飛虱的存活率

3 討論

昆蟲(chóng)在生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中要經(jīng)歷舊表皮的蛻去和新表皮的生長(zhǎng)，而幾丁質(zhì)作為昆蟲(chóng)表皮的主要成分，其合成和分解也是被嚴(yán)格調(diào)控的。在幾丁質(zhì)合成的過(guò)程中，CHS扮演著非常重要的作用，是幾丁質(zhì)合成的關(guān)鍵酶。通過(guò)本課題組前期的白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，獲得了白背飛虱CHS1基因的全長(zhǎng)序列。目前，研究發(fā)現(xiàn)在很多昆蟲(chóng)中CHS1基因存在可變剪接的現(xiàn)象，如岡比亞按蚊、赤擬谷盜、桔小實(shí)蠅、褐飛虱等［13-17］。為了探究白背飛虱中是否也存在這樣的可變剪接，對(duì)比了白背飛虱和褐飛虱的CHS1基因序列，在可能出現(xiàn)可變剪接的位置設(shè)計(jì)了引物進(jìn)行序列的擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在白背飛虱中也是存在兩個(gè)可變外顯子。利用進(jìn)化樹(shù)分析軟件Mega 7分析白背飛虱與其它昆蟲(chóng)CHS1蛋白的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果顯示白背飛虱CHS1蛋白與同為同翅目的昆蟲(chóng)親緣關(guān)系較近，聚為一小支，其中，又與飛虱科的褐飛虱及灰飛虱的關(guān)系最近。進(jìn)化樹(shù)分析的結(jié)果在一定程度上反映了CHS1蛋白的進(jìn)化歷程，為后續(xù)CHS1基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。然后采用熒光定量PCR的方法對(duì)白背飛虱CHS1基因在8個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)的mRNA表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHS1基因存在明顯的時(shí)間表達(dá)特異性，在白背飛虱若蟲(chóng)4齡和5齡期的第1天表達(dá)量最高，隨即快速下降，在成蟲(chóng)期的第1天也會(huì)上升，而后逐漸下降。這一結(jié)果表明在每個(gè)齡期初始，即需要大量幾丁質(zhì)參與表皮形成時(shí)，參與幾丁質(zhì)合成的CHS1基因的mRNA表達(dá)量會(huì)快速升高，而在每個(gè)齡期的最后1 d，即蛻皮開(kāi)始時(shí)，表達(dá)量是最低的。同樣，采用熒光定量PCR的方法，我們檢測(cè)了CHS1基因在白背飛虱3個(gè)組織器官中mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHS1基因在檢測(cè)的3個(gè)組織即表皮、氣管和中腸中都有表達(dá)，但是表達(dá)量存在極顯著差異。其中，在表皮中的表達(dá)量最高。應(yīng)該是在表皮合成的過(guò)程中，需要大量幾丁質(zhì)的原因。另外，幾丁質(zhì)也是氣管的重要組成部分，所以在氣管中也檢測(cè)到了CHS1基因的表達(dá)，只是表達(dá)量顯著低于表皮中。在中腸中也檢測(cè)到了CHS1基因的少量表達(dá)，推測(cè)可能是在中腸中有含有幾丁質(zhì)的組織，也有可能是解剖中腸的時(shí)候，上面粘黏了氣管組織。

目前，褐飛虱已成為我國(guó)水稻上的首要害蟲(chóng)，而殺蟲(chóng)劑大規(guī)模使用帶來(lái)的害蟲(chóng)抗藥性和對(duì)環(huán)境的污染使無(wú)害防治理念逐漸形成。目前，利用RNAi技術(shù)防治褐飛虱的研究報(bào)道已有很多，像通過(guò)飼喂法RNAi技術(shù)研究海藻糖合成酶的功能［18］，構(gòu)建RNAi載體轉(zhuǎn)化水稻研究特定基因的功能等［19］。而RNAi轉(zhuǎn)基因水稻將有可能成為防治褐飛虱的潛在方法。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)注射法RNAi干擾檢測(cè)SfCHS1基因在mRNA表達(dá)水平上的沉默效果。結(jié)果顯示，注射較低劑量（10 ng/頭）的雙鏈RNA即可產(chǎn)生較好的干擾效果，顯著降低SfCHS1基因的表達(dá)及產(chǎn)生明顯的死亡表型。通過(guò)本研究對(duì)SfCHS1基因的干擾研究，為探究其功能和作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)前期對(duì)白背飛虱進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，獲得了白背飛虱幾丁質(zhì)合成酶1基因 SfCHS1的cDNA全長(zhǎng)序列。SfCHS1基因開(kāi)放閱讀框?yàn)? 719 bp，編碼1 572個(gè)氨基酸。PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果表明SfCHS1基因存在兩個(gè)可變剪切，產(chǎn)生兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本（CHS1a和CHS1b）。時(shí)間表達(dá)特異性分析結(jié)果表明，SfCHS1在每個(gè)齡期的第1天即幾丁質(zhì)合成時(shí)的表達(dá)量最高。組織特異性檢測(cè)結(jié)果表明，SfCHS1主要在白背飛虱的表皮中表達(dá)，其次為氣管，在中腸中也有少量表達(dá)。顯微注射RNAi的結(jié)果表明該方法能顯著降低SfCHS1基因的轉(zhuǎn)錄水平，達(dá)到良好的RNAi效果并產(chǎn)生顯著的死亡表型。

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