柳瑩 高麗 馮俊榮

（煙臺(tái)大學(xué)海洋學(xué)院，煙臺(tái) 264005）

作為真核細(xì)胞內(nèi)部最重要的細(xì)胞器之一，線粒體（mitochondrion）是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的重要場(chǎng)所，承擔(dān)著能量制造的主要任務(wù)。除此之外，線粒體還具有細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡的調(diào)控［1］、細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)態(tài)平衡的維系［2］等重要的功能。傳統(tǒng)的共生學(xué)說(shuō)認(rèn)為線粒體最初來(lái)源于被吞噬的細(xì)菌，因此線粒體內(nèi)含有環(huán)狀閉合雙鏈DNA組分，在遺傳上具有一定的獨(dú)立性，與核基因組DNA 相比，線粒體DNA（mitochondrion DNA，mtDNA）使用的遺傳密碼表也略有差異。在不同的組織細(xì)胞中，線粒體的數(shù)量差異較大，從幾個(gè)到幾千個(gè)不等。線粒體DNA由于暴露在高濃度活性氧的環(huán)境中，自身缺乏蛋白的保護(hù)及損傷修復(fù)系統(tǒng)，因此更容易受到氧化損傷且突變率較高［3］。因?yàn)閙tDNA具有母系遺傳且?guī)缀醪话l(fā)生基因重組的特性，所以長(zhǎng)期以來(lái)被當(dāng)做是重要的分子標(biāo)記，用于群體遺傳學(xué)及演化生物學(xué)的研究，如現(xiàn)代人類進(jìn)化譜系的構(gòu)建及遷移路線的確立等。

1 線粒體DNA的甲基化特征

1.1 線粒體DNA的結(jié)構(gòu)特征

真核生物線粒體基因組為環(huán)狀DNA，其中外環(huán)DNA單鏈由于分子量較大而被稱為重鏈（Heavy strand，H strand），內(nèi)環(huán)DNA單鏈由于分子量較小而被稱為輕鏈（Light strand，L strand）。mtDNA的兩條鏈都有編碼功能且基因排列緊密，除了一個(gè)包含有兩個(gè)啟動(dòng)子、負(fù)責(zé)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起始的控制區(qū)（Displacement loop，D-loop）之外，基因間無(wú)內(nèi)含子序列，部分基因還存在有重疊現(xiàn)象。這兩條鏈被轉(zhuǎn)錄為較大的多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄前體，進(jìn)而被加工成獨(dú)立的功能單位，共含有37個(gè)基因，包括兩個(gè)rRNA基因（16SrRNA，12SrRNA），22個(gè)tRNA基因以及13個(gè)疏水蛋白基因（細(xì)胞色素b，細(xì)胞色素c氧化酶亞基COI，COII和COIII，ATP合成酶亞基ATPase6和ATPase8，NADH脫氫酶亞基ND1，ND2，ND3，ND4，ND4L，ND5，ND6）［5］。 其 中 L 鏈 僅 編 碼ND6和7個(gè)tRNA基因，其余均由H鏈編碼。

1.2 線粒體的DNA甲基化酶

在真核細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)有多種DNA甲基化酶的存在，其中DNMT3 蛋白質(zhì)家族負(fù)責(zé)甲基化核苷酸的初始合成（從頭甲基化），DNMT1 蛋白質(zhì)家族負(fù)責(zé)復(fù)制過(guò)程中已有甲基化模式的維系（維持甲基化），而DNMT2 蛋白質(zhì)家族則負(fù)責(zé)tRNA的甲基化［6］。在線粒體中，通常由DNMT1的同型mtDNMT1負(fù)責(zé)胞嘧啶5'位置甲基的添加。mtDNMT1雖然由核DNA編碼，但是合成后被定位至線粒體內(nèi)發(fā)揮作用。后來(lái)，在線粒體中又發(fā)現(xiàn)了甲基化酶DNMT3A［7］和DNMT3B［8］。研究證明了從頭甲基化酶DNMT3A和DNMT3B不僅可以將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5mC，還具有氧化還原依賴性的脫羥甲基化酶（dehydroxymethylase）活性，可以將5hmC轉(zhuǎn)化為胞嘧啶，因此在基因的表達(dá)調(diào)控過(guò)程中起到了重要的作用［9］。

1.3 線粒體的DNA甲基化模式

在真核生物nDNA中，絕大多數(shù)的甲基化位點(diǎn)是CpG二核苷酸序列之中的胞嘧啶，在mtDNA中也發(fā)現(xiàn)了類似的情況［4］。在真核生物中，由于甲基化的胞嘧啶可以自發(fā)性地脫氨形成胸腺嘧啶，這一突變很難被DNA 修復(fù)機(jī)制所識(shí)別糾正，隨著時(shí)間的推移，基因組中的CpG含量會(huì)逐漸降低。以人類基因組為例，其中CpG含量約為1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于理論上4.4%的出現(xiàn)概率［10］，其中70%-80%的CpG處于甲基化狀態(tài)，非甲基化的CpG不是均勻分布在基因組上，而是成簇出現(xiàn)形成CpG密度較高的區(qū)域，即CpG島［11］。在mtDNA中CpG含量約為2.65%，缺乏CpG島的存在，但整體的甲基化水平較低［12］。

對(duì)人體mtDNA的分析表明，對(duì)不同的細(xì)胞和組織而言，線粒體內(nèi)甲基化胞嘧啶的分布呈現(xiàn)出較為保守的分布模式，只有特定樣本的部分區(qū)域出現(xiàn)了較大差異，顯示出明顯的時(shí)間和功能特征，如大腦和血液［13］。對(duì)人類和小鼠血液細(xì)胞mtDNA的D-loop區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化主要發(fā)生于重鏈的啟動(dòng)子區(qū)和保守序列區(qū)，其作用可能是調(diào)節(jié)線粒體DNA的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄［14］。令人意外的是，DNA甲基化的主要位點(diǎn)不是動(dòng)物中常見的CpG二核苷酸，而是只有在植物和真菌中發(fā)現(xiàn)過(guò)的非CpG二核苷酸。在小鼠胚胎干細(xì)胞線粒體中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的失活將導(dǎo)致CpG序列的甲基化水平下降，但非CpG序列的甲基化水平則不受影響［14］。

1.4 線粒體的DNA羥甲基化模式

雖然早在1972年就在哺乳動(dòng)物nDNA中發(fā)現(xiàn)了5hmC的存在［15］，但是其產(chǎn)生機(jī)制直到2009年才得以揭示。對(duì)小鼠腦組織的研究表明，TET（ten-eleven translocation）蛋白家族具有將5mC轉(zhuǎn)化為5hmC的能力［16］，其后5hmC將通過(guò)一系列途徑被胞嘧啶取代，從而實(shí)現(xiàn)DNA的去甲基化過(guò)程。值得注意的是，5hmC的產(chǎn)生被認(rèn)為是DNA氧化損傷的產(chǎn)物，與許多腦組織疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)［17］。對(duì)于線粒體而言，其DNA所處環(huán)境中活性氧自由基的含量較高，更易受到氧化損傷。對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞中的研究中發(fā)現(xiàn)，mtDNA中5hmC的密度要顯著高于nDNA［18］。在線粒體中，5hmC有可能作為5mC去甲基化過(guò)程的中間產(chǎn)物存在，從而和DNMT及TET蛋白一起，在基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用［14］。

2 線粒體DNA甲基化對(duì)于基因表達(dá)的調(diào)控

2.1 線粒體DNA的甲基化調(diào)控

在真核生物nDNA中，基因數(shù)目眾多，表達(dá)狀態(tài)復(fù)雜多變。對(duì)特定基因而言，可以通過(guò)改變啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)來(lái)上調(diào)或下調(diào)其轉(zhuǎn)錄水平。而在mtDNA中，只有D-loop中含有啟動(dòng)子序列，其余絕大多數(shù)序列為編碼序列，負(fù)責(zé)合成呼吸鏈的重要組分。因此，線粒體DNA的表達(dá)應(yīng)與其甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，以應(yīng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)部時(shí)刻變化的動(dòng)力需求［11］。除此之外，線粒體DNA甲基化模式的改變還將對(duì)重鏈和輕鏈的表達(dá)產(chǎn)生不同的影響。例如，mtDNMT1的過(guò)量表達(dá)將導(dǎo)致重鏈編碼的ND1的表達(dá)上調(diào)，而與此同時(shí)輕鏈編碼的ND6的表達(dá)則出現(xiàn)下調(diào)［4］。

2.2 線粒體DNA甲基化的影響因素

2.2.1 營(yíng)養(yǎng) 研究發(fā)現(xiàn)母體孕期低蛋白飲食將導(dǎo)致仔豬mtDNA的表觀遺傳改變，其中雄性仔豬mtDNA啟動(dòng)子區(qū)的胞嘧啶甲基化和羥甲基化水平下降，糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid receptor，GR）與mtDNA啟動(dòng)子的結(jié)合能力上升，有趣的是，在雌性仔豬體內(nèi)觀察到了完全相反的結(jié)果，即mtDNA啟動(dòng)子區(qū)的胞嘧啶甲基化和羥甲基化水平上升，GR與mtDNA啟動(dòng)子的結(jié)合能力下降［19］。因此，母體孕期的飲食情況可以通過(guò)GR對(duì)不同性別仔豬的氧化磷酸化基因產(chǎn)生不同影響。對(duì)于大黃魚肝臟細(xì)胞mtDNA的研究也發(fā)現(xiàn)，橄欖油和紫蘇油的攝入會(huì)對(duì)其甲基化狀態(tài)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致線粒體精氨酸t(yī)RNA及NADH脫氫酶亞基ND4L的甲基化水平上升［20］。

2.2.2 環(huán)境污染物 研究發(fā)現(xiàn)金屬離子會(huì)對(duì)成年男性白細(xì)胞層mtDNA的甲基化狀態(tài)產(chǎn)生影響［21］，鍍鉻工人體內(nèi)較高的鉻離子濃度也與其細(xì)胞mtDNA的甲基化水平出現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)［22］，對(duì)從事特定工作的成年男性而言，工作環(huán)境空氣中PM2.5水平與其血細(xì)胞中D-loop啟動(dòng)區(qū)的甲基化水平呈現(xiàn)正相關(guān)［23］。對(duì)于圍產(chǎn)期小鼠而言，環(huán)境中 2，2'，4，4'-四溴聯(lián)苯醚（BDE-47）的存在將對(duì)其后代腦細(xì)胞mtDNA的甲基化狀態(tài)產(chǎn)生關(guān)聯(lián)［24］。對(duì)于妊娠期婦女而言，吸煙者的胎盤內(nèi)相對(duì)mtDNA含量較低而mtDNA甲基化水平較高［25］，而空氣中PM2.5的含量也與妊娠期婦女胎盤中mtDNA含量成負(fù)相關(guān)而與mtDNA甲基化水平成正相關(guān)［26］，因此環(huán)境因子對(duì)于孕期線粒體表觀遺傳狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生重要影響。

2.2.3 疾病 早有證據(jù)顯示，mtDNA的甲基化狀態(tài)與疾病的發(fā)生密切相關(guān)，這一現(xiàn)象在能量需求較高的器官如心臟和大腦中表現(xiàn)得尤為明顯［27］。有研究表明，在心血管疾病患者的血小板中出現(xiàn)了DNA甲基化水平升高的情況［28］，也有研究發(fā)現(xiàn)，人腦內(nèi)的mtDNA甲基化水平易受神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病和帕金森病的影響［29］。對(duì)耐胰島素的肥胖患者［30］及糖尿病視網(wǎng)膜病變患者［31］的研究均發(fā)現(xiàn)，其體內(nèi)線粒體D-loop區(qū)的甲基化水平出現(xiàn)了明顯的升高，從而導(dǎo)致mtDNA轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)。對(duì)非酒精性脂肪性肝病患者的研究則發(fā)現(xiàn)，其肝臟的組織學(xué)損傷嚴(yán)重程度與mtDNA的D-loop區(qū)及COI編碼區(qū)的甲基化水平呈現(xiàn)正相關(guān)［32］。因此，線粒體的DNA甲基化狀態(tài)可以發(fā)展為新一代的生物標(biāo)記，用于特定疾病的檢查和診斷工作［33］。

2.2.4 衰老 在細(xì)胞衰老過(guò)程中，線粒體的數(shù)量和功能將發(fā)生明顯改變，其中氧自由基對(duì)線粒體的損傷及mtDNA的突變有著重要的影響。在表觀遺傳調(diào)控方面，對(duì)4個(gè)月和24個(gè)月大的小鼠腦細(xì)胞mtDNA的研究表明，額葉皮層區(qū)域5hmC水平將隨年齡的增長(zhǎng)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)［34］。另外，衰老還會(huì)影響到mtDNMT1及TET蛋白的合成。衰老過(guò)程中額葉皮層區(qū)域mtDNMT1的mRNA水平出現(xiàn)下降，而小腦區(qū)域TET2及TET3的mRNA含量出現(xiàn)上升，進(jìn)而對(duì)5hmC的含量產(chǎn)生影響［34］。人類衰老也會(huì)導(dǎo)致mtDNA 中的 D-loop［8］及 12S rRNA 編碼區(qū)［35］的甲基化狀態(tài)出現(xiàn)相應(yīng)的改變。在哺乳動(dòng)物的配子發(fā)育過(guò)程中，胚胎干細(xì)胞mtDNA通常表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)而生殖細(xì)胞則出現(xiàn)了部分的甲基化［36］。與卵母細(xì)胞相比，精子的線粒體中甲基化程度更高，對(duì)其中基因的表達(dá)起到了一定的抑制作用［37］。

3 線粒體DNA的其他表觀遺傳機(jī)制

3.1 線粒體長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Mitochondrial long noncoding RNA，mtlncRNA）

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼RNA。在真核生物中l(wèi)ncRNA的表達(dá)多數(shù)與發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)，lncRNA可以通過(guò)與蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)或基因組中互補(bǔ)序列的結(jié)合來(lái)參與基因表達(dá)的表觀調(diào)控［38］。在線粒體中，也存在有mtDNA編碼的lncRNA即mtlncRNA。研究發(fā)現(xiàn)，ND5、ND6 和Cytb 編碼區(qū)的互補(bǔ)序列可以轉(zhuǎn)錄合成較高水平的lncRNA，這3種mtlncRNA 可以與其互補(bǔ)的mRNA形成耐核糖核酸酶降解的雙鏈結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控其表達(dá)水平［39］。在不同的人體組織中，lncND5、lncND6和lncCytbRNA的豐度有明顯不同。與位于相對(duì)鏈的mRNA 相比，不同lncRNA 的比值也不同［39］。根據(jù)mtlncRNA的轉(zhuǎn)錄模板與臨近的蛋白質(zhì)編碼基因之間的位置關(guān)系，可以將其分為正義線粒體非編碼RNA（Sense mitochondrial noncoding RNA，Sncmt RNA）和反義線粒體非編碼RNA（Antisense mitochondrial noncoding RNA，ASnc mtRNA）。研究發(fā)現(xiàn)，在不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞中，均出現(xiàn)了ASnc mtRNA表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，而幾個(gè)腫瘤細(xì)胞系中低拷貝的ASnc mtRNA的去除將會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［40］。因此，線粒體基因表達(dá)的調(diào)控可能取決于特定細(xì)胞類型的需求，mtlncRNA可能在這一過(guò)程中起到了重要作用。

3.2 線粒體MicroRNA

MicroRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其主要作用是參與轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控。在線粒體基質(zhì)中，即存在有mtDNA編碼的miRNA又存在有nDNA編碼的miRNA。對(duì)于線粒體miRNA的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其靶序列與部分線粒體中的蛋白質(zhì)編碼序列相符，從而證明了其可能發(fā)揮的調(diào)控作用［41］。一個(gè)尤為有趣的發(fā)現(xiàn)是在接受嗅覺(jué)辨別訓(xùn)練的小鼠的海馬區(qū)域，一種由線粒體控制區(qū)的終止結(jié)合序列（Termination association sequence，TAS）負(fù)責(zé)編碼的miRNA的豐度出現(xiàn)了明顯的上升（超出對(duì)照組50倍）［42］。由于TAS在DNA復(fù)制過(guò)程中的重要作用，因此這一過(guò)程中miRNA可能將小鼠的行為可塑性與線粒體的復(fù)制和蛋白質(zhì)合成聯(lián)系起來(lái)［42］。目前，線粒體miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的資料也在不斷地積累過(guò)程中，據(jù)推測(cè)miRNA也可通過(guò)影響mtDNA轉(zhuǎn)錄物的活性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生物能量的產(chǎn)生過(guò)程［43］。

3.3 線粒體DNA結(jié)合蛋白

對(duì)于nDNA而言，組蛋白的翻譯后修飾與染色體的重塑和功能狀態(tài)密切相關(guān)，其中組蛋白的乙?；c去乙?；瘯?huì)對(duì)基因的活化與失活產(chǎn)生重要影響。在線粒體中，2011年發(fā)現(xiàn)了與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)骨架的存在，其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能類似于細(xì)菌的類核［44］。有研究發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)同樣存在有組蛋白去乙酰化酶SirT3，基因敲除SirT3，會(huì)導(dǎo)致線粒體內(nèi)蛋白的高度乙?；?，進(jìn)而影響線粒體的生物合成及氧化磷酸化進(jìn)程［45］。對(duì)于人類線粒體轉(zhuǎn)錄組的研究還表明，在線粒體基質(zhì)中有DNA調(diào)控蛋白的存在［46］。這些重要的發(fā)現(xiàn)表明線粒體中的基因表達(dá)存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，雖然目前相關(guān)研究還處于起步階段，但mtDNA結(jié)合蛋白的修飾及其與mtDNA的相互作用也將成為表觀遺傳研究的重要組成部分。

4 展望

4.1 技術(shù)手段的完善

在mtDNA的相關(guān)研究中，技術(shù)上的難點(diǎn)之一是如何避免由nDNA的污染造成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。因?yàn)樵谏锘蚪M的演化過(guò)程中，曾多次發(fā)生過(guò)線粒體基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞核的事件。這些基因片段在轉(zhuǎn)入核后失去了功能，被命名為線粒體假基因（Nuclear mitochondrial sequences，Numts）［47］。目前在許多基因組中已證實(shí)有Numts的插入，由于其失去了編碼功能，因而整體呈現(xiàn)出比mtDNA更快的進(jìn)化速率［48］。由于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法很難將其與mtDNA區(qū)分，因此會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。解決這一問(wèn)題的方法包括：（1）選用含有線粒體但不含有細(xì)胞核的實(shí)驗(yàn)材料（如血小板）；（2）設(shè)計(jì)與mtDNA特異性結(jié)合的引物；（3）消除mtDNA提取物中nDNA的污染，但是這些方法要么限制了實(shí)驗(yàn)材料的來(lái)源，要么限制了PCR擴(kuò)增的區(qū)域，要么對(duì)實(shí)驗(yàn)操作提出了極高的要求［49］。目前有關(guān)細(xì)胞DNA提取物中純mtDNA的提取方法還在不斷地改良過(guò)程中，未來(lái)新方法應(yīng)在降低實(shí)驗(yàn)難度、提高結(jié)果精確度等方面作出改善。

4.2 線粒體與細(xì)胞核之間的遺傳調(diào)控關(guān)聯(lián)

作為半自主遺傳的細(xì)胞器，線粒體雖然具有獨(dú)立轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能，但是卻有超過(guò)1 000 個(gè)線粒體蛋白質(zhì)的編碼基因在進(jìn)化過(guò)程中被轉(zhuǎn)移到了核基因組內(nèi)［50］，因此nDNA的遺傳調(diào)控將對(duì)線粒體的基因表達(dá)產(chǎn)生較大的影響。另一方面，細(xì)胞內(nèi)線粒體的移除也會(huì)使nDNA的甲基化狀態(tài)發(fā)生極為顯著的改變，這一改變是可逆性的，將線粒體重新導(dǎo)入細(xì)胞后又會(huì)發(fā)生甲基化狀態(tài)的恢復(fù)［51］。有研究發(fā)現(xiàn)，歐洲人群體的mtDNA可分為9個(gè)主要的單倍型（H、J、U、X、T、I、K、W和V），其中J型個(gè)體的nDNA甲基化水平要普遍高于非J型個(gè)體［52］。種種跡象表明，mtDNA與nDNA的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之間存在復(fù)雜的聯(lián)系，許多nDNA甲基化的影響因素如疾病、衰老及污染物等也在mtDNA中發(fā)揮作用。未來(lái)的研究將在mtDNA的表觀調(diào)控機(jī)制及功能等方面作出進(jìn)一步的探索，其與細(xì)胞核之間遺傳調(diào)控的關(guān)聯(lián)也將得到更深層次的揭示。

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