郭紅艷 高涵 吳琦 孫曉杰 劉秀財 趙立群

（1. 齊齊哈爾醫(yī)學院生物化學教研室，齊齊哈爾 161006；2. 齊齊哈爾醫(yī)學院臨床生化教研室，齊齊哈爾 161006；3. 齊齊哈爾醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學影像CT室，齊齊哈爾 161041）

血清和糖皮質激素誘導的蛋白激酶3（serumand glucocorticoid regulated protein kinase 3，SGK3）是PI3K信號通路中的下游分子，近年來研究發(fā)現(xiàn)該激酶可誘導腫瘤血管生成，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，是某些腫瘤分子診斷、治療的潛在靶點［1-2］。SGK3可促進黑色素瘤、前列腺癌細胞增殖，靶向抑制SGK3可降低GBM細胞的增殖活性，SGK3的異位表達增強乳腺癌細胞侵襲性遷移，相反，SGK3 shRNA則減弱腫瘤細胞遷移［3-4，9］，而本課題組前期研究顯示，SGK3在乳腺癌組織中的表達高于正常組織，且與ER等臨床病理特征相關，過表達SGK3可促進乳腺癌細胞增殖，抑制其凋亡和侵襲轉移［5-6］。本研究在此基礎上，構建SGK3基因RNAi慢病毒載體，并進一步在細胞水平觀察SGK3基因沉默對人乳腺癌細胞MB-474增殖等生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

MB-474細胞、293T 細胞購自上海中科院細胞庫，重組穿梭質粒和包裝質粒 pGag/Pol、pRev、pVSV-G、RNAi-Mate 轉染試劑購自上海吉瑪構建 制 備，SYBR Premix Ex TaqTM、Prime Script TM RT reagent Kit購自TaKaRa 公司，胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板為Nunc公司產品，胎牛血清購自Gibco 公司，GAPDH、SGK3引物由上海生工公司合成，辣根酶標記山羊抗兔IgG購自SANTA CRUZ公司，GAPDH、SGK3 antibody購自Proteintech公司、蛋白抽提、定量試劑盒購自碧云天生物技術公司、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京嘉美生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 靶向SGK3基因的shRNA慢病毒表達載體的構建及包裝 從 GenBank查找SGK3基因序列（NM_001033578.2），設計4條針對人SGK3基因的特異性 shRNA 序列（表1），以通用序列（Negative control，NC）作為陰性對照，由蘇州吉瑪基因股份有限公司構建，靶向SGK3基因的shRNA慢病毒表達載體，菌落PCR篩選重組陽性克隆進行測序鑒定；對數(shù)生長期的293T細胞 4×106接種于15 cm培養(yǎng)皿中，含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)過夜，棄去培養(yǎng)液，將pGC-LV-GFP-SGK3和包裝質粒pGag/Pol、pRev、pVSV-GD及無血清DMEM混勻后，RNAi-Mate介導轉染293T細胞，37℃溫育6 h后更換為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細胞上清液，4℃，4 000 r/min，離心4 min，0.45 μm 過濾器過濾上清，與 4℃，20 000 r/min，離心2 h后收集、分裝病毒液，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 針對SGK3 基因的4 個 siRNA 靶序列

1.2.2 病毒滴度測定 293T細胞以1×104細胞/ 孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，將慢病毒原液用DMEM培養(yǎng)液10倍稀釋4個梯度，每個稀釋度3個復孔，在孔板中加入100 μL 慢病毒稀釋液培養(yǎng)24 h，更換為DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，并計算病毒原液滴度：病毒滴度（TU/mL）= 熒光細胞個數(shù)×1 000/每病毒原液量（μL）。

1.2.3 Real-time PCR檢測MB-474細胞SGK3 mRNA表達 收集各組慢病毒轉染和對照組細胞，提取細胞總RNA逆轉錄，以GAPDH為內參照，定量分析SGK3基因mRNA表達（按說明書操作），SGK3引物序列為：上游5'-GATCCGGCGCCTTCCC-3'，下游5'-CCATCATGCAACCTGGCCC-3'；GAPDH引物序列為：上游5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，反應條件如下：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)，計算2-△△Ct值比較各目的基因初始模板量差別。

1.2.4 Western blot 檢測MB-474細胞SGK3蛋白表達 收集各組細胞，進行細胞總蛋白提取及含量測定，取40 μg總蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，轉NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別用SGK3抗體（1∶1 000）、GAPDH 抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜，辣根酶標記的羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1.5 h，TBST洗膜后ECL顯色成像后，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶，以SGK3與GAPDH條帶積分光密度比值表示蛋白表達。

1.2.5 MTT方法檢測SGK3基因沉默對細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的MB-474細胞、474-LV3-VC細胞和PGC-LV3-SGK3-1組細胞，按1×103細胞/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，每組設4 個平行孔，于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每天取出一塊培養(yǎng)板，加MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后棄培養(yǎng)液，加150 μL DMSO，震蕩15 min 后用酶標儀在570 nm測定吸光度值，做細胞增長曲線，觀察細胞的增殖情況。

1.2.6 流式細胞術檢測SGK3基因沉默對細胞周期的影響 細胞培養(yǎng)48 h后 0.25%胰酶消化處理各組培養(yǎng)細胞，1 000 r/min離心10 min收集細胞，用冰預冷的PBS洗兩次，PI染色30 min后上流式細胞儀檢測細胞周期，以標準程序用FACS（Becton-DickinsonUSA）檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處的紅色熒光，資料經(jīng)ModFitL T 軟件分析。

1.2.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以x-±s表示；多組間資料相互比較進行方差分析，LSD檢驗，結果以P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 重組慢病毒載體的測序鑒定

將4組構建的表達載體的陽性克隆行DNA測序，測序結果如圖1所示與設計的shRNA核苷酸序列完全一致，說明已成功構建針對SGK3基因的重組慢病毒載體pGC-LV3-GFP-SGK3。

2.2 病毒滴度測定

各組慢病毒載體轉染293T細胞72 h后，熒光顯微鏡均可見較強綠色熒光（圖2），將病毒原液梯度稀釋并感染293T細胞后，計數(shù)各孔中表達綠色熒光的細胞數(shù)，最終測得 pGC-LV-GFP-SGK3-1、2、3、4 病毒原液滴度值分別為 4×108、3×108、4×108和8×108TU/mL，提示病毒包裝成功。

2.3 轉染后SGK3 mRNA 水平的變化

Real-time PCR檢測MB-474細胞轉染外源基因SGK3特異性shRNA后，474-LV3-VC對照組SGK3 mRNA 表達抑制率為0.943 8±0.092 7。與其相比，PGC-LV3-SGK3-1、2、3、4實驗組的 SGK3 mRNA表達水平均有不同程度降低，各組SGK3 mRNA的抑制率分別為0.233 0±0.072 9、0.307 2±0.072 1、0.514 9±0.035 7 和 0.597 2±0.096， 其 中 PGCLV3-SGK3-1在mRNA 表達水平抑制效果最為顯著（#△P＜0.01）（圖 3）。

圖1 pGC-LV3-GFP-SGK3測序結果

圖2 將重組病毒載體轉染后293T細胞后熒光顯微鏡下觀察GFP（40×）

2.4 慢病毒轉染后下調SGK3的蛋白表達

Western blot結果（圖4-A）表明，與MB-474細胞和474-LV3-VC組相比，其他各組細胞SGK3蛋白表達量雖均有不同程度降低，但其中PGCLV3-SGK3-1蛋白表達水平抑制具有統(tǒng)計學意義（△P＜0.01）（圖 4-B）。

圖3 轉染慢病毒后各組細胞SGK3 mRNA水平

圖4 染慢病毒后各組細胞SGK3蛋白的達

2.5 SGK3基因沉默抑制細胞增殖

MTT實驗結果（圖5）顯示，MB-474細胞和474-LV3-VC細胞生長增殖速度無明顯差異（P＞0.05），而 PGC-LV3-SGK3-1細胞在接種 3 d后生長增殖較前二者速度明顯減慢（P＜0.01），各組細胞倍增時間分別為（36.752 3±2.880 05）h、（35.278 9±5.629 52）h 和（44.490 7±9.328 99）h。

圖5 各組MB-474細胞生長曲線

2.6 SGK3基因沉默對細胞周期的影響

流式細胞術檢測細胞周期結果（圖6）顯示：MB-474細胞和474-LV3-VC和PGC-LV3-SGK3-1組細胞的G1期比例分別為（71.867±7.882）%、（61.203±9.623）%、（55.617±10.171）% ；G2期 比 例 分 別 為（8.5167±1.580）%、（9.283±0.799）%、（11.253±4.197）%；S期所占比列為（19.6133±10.171）%、（26.5133±3.904）%、（33.220±6.570）%；細胞凋亡比例為（9.807±2.072）%、（10.613±2.905）%、（15.767±1.185）%，即各組細胞在細胞周期G1、G2、S期的比例大致相近，無明顯差異（P＞0.05）；PGC-LV3-SGK3-1細胞細胞凋亡比例卻增加（*▲P＜0.05）。

3 討論

1999年SGK3作為SGK家族的新成員被發(fā)現(xiàn)以來，學者們對該激酶的功能、與人類疾病及腫瘤的相關性等進行了積極的研究和探索［7-9］，有觀點認為，SGK3可以作為某些腫瘤治療的靶點及預后標志物［10］，近年來，有關SGK3與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關系也逐漸引起重視。有報道指出，SGK3與乳腺癌雌激素（ER）受體表達相關、具有介導乳腺癌中INPP4B依賴性PI3K信號傳導的功能［4，11］。本課題組近年來研究結果顯示，SGK3在浸潤性乳腺癌中的表達較正常乳腺組織增高，SGK3過表達會影響乳腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲遷移等惡性生物學行為［12］，而SGK3基因沉默對乳腺癌細胞的生物學行為是否也會產生影響，本實驗研究構建SGK3基因RNAi慢病毒載體，沉默MB-474乳腺癌細胞SGK3基因表達。結果表明SGK3基因沉默可抑制MB-474細胞增殖，延長其倍增時間雖然對MB-474細胞周期無明顯影像（P＞0.05），但可促進其凋亡（P＜0.05），提示SGK3 基因沉默能有效抑制乳腺癌的部分惡性生物學行為。

圖6 SGK3基因沉默對乳腺癌MB-474細胞周期的影

值得一提的是，雖然Akt在乳腺癌的作用已被廣泛研究，但SGK3作為PI3K下游的獨立信號分子［13-14］，其在乳腺癌中的作用發(fā)揮的作用和機制目前仍不清楚，研究者們也在力求從多角度闡述SGK3與乳腺癌的關系及其作用機制［8，15］。本課題前期研究結果表明，SGK3過表達會影響乳腺癌細胞凋亡、侵襲相關基因的表達，同時對PI3K/AKT細胞信號轉導通路的某些關鍵因子如GSK3β等的表達產生影響，SGK3 基因沉默是否會乳腺癌細胞凋亡、侵襲相關基因的表達，其抑制乳腺癌細胞生物學行為具體的信號轉導機制如何，需要在后續(xù)研究工作中進一步探討和研究。此外，SGK3與乳腺癌TNM分級、AR、Ki67等影響乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、預后的臨床病理特征是否相關；是否可以作為乳腺癌治療的靶點及預后標志物等問題將是今后的研究方向。

4 結論

成功構建靶向人SGK3基因的RNAi慢病毒載體，篩選出高效干擾MB-474細胞SGK3基因表達的有效靶點，初步證實SGK3基因沉默可對乳腺癌細胞周期無明顯影響，但可抑制其增殖，促進其凋亡。

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