呂 強 陳洪生 李國東 魏九峰 綜述 劉 明 審校

大腸癌(Colorectal cancer，CRC)是人類主要惡性腫瘤之一，每年全球有約120萬名患者被確診為大腸癌，超過60萬名患者直接或間接死于CRC。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與其生存環(huán)境密切相關，這種由腫瘤細胞本身、腫瘤相關成纖維細胞(Cancer-associated-fibroblasts，CAFs)、免疫細胞、血管內(nèi)皮細胞以及細胞外基質(zhì)等共同構(gòu)成的內(nèi)環(huán)境稱之為腫瘤微環(huán)境[1]。其中，CAFs是腫瘤微環(huán)境中的主要細胞成分。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CAFs通過與腫瘤細胞及其他類型細胞發(fā)生相互作用，分泌多種細胞因子，進而促進腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，在CRC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

1 CAFs概述

成纖維細胞是基質(zhì)中的一種主要細胞類型，通過提供結(jié)構(gòu)支架和分泌纖維連結(jié)蛋白等細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)成分，促進組織發(fā)育并維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)。在腫瘤微環(huán)境中存在活化的成纖維細胞，被稱為CAFs或腫瘤間質(zhì)細胞。CAFs外形呈紡錘形，具有很強的增殖和遷移能力。研究表明，CAFs在腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥性等方面起著至關重要的作用，且間質(zhì)中較高含量的CAFs與CRC患者較差的預后有關[2]。

CAFs具有高度異質(zhì)性，這主要體現(xiàn)在其來源廣泛，生物標記物多樣等特征。CAFs的生物標記物包括：α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、成纖維細胞活化蛋白α(Fibroblast activation protein-α，F(xiàn)AP-α)、成纖維細胞特異性蛋白-1(FSP-1)、神經(jīng)/膠質(zhì)細胞抗原2(Neuron-glial antigen-2)、血小板衍生生長因子受體(Platelet derived growth factor，PDGF)、脯氨酰羥化酶(Prolyl hydroxylase)等[3]。CAFs的生物標記物雖然眾多，但都缺乏特異性。在腫瘤生物學當中，CAFs雖然是研究最多的細胞類型之一，但由于其缺乏特異性生物標記物使得我們對CAFs的最終來源還不確定。目前已知的CAFs的可能來源包括腫瘤組織自身成纖維細胞的活化、骨髓來源干細胞分化、上皮細胞通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)等[4]。越來越多的證據(jù)表明，CAFs在結(jié)腸癌組織當中具有高度異質(zhì)性。CAFs可由腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細胞及其他類型細胞間的相互作用而產(chǎn)生。因此，腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性可以引起CAFs的廣泛變異。

2 CAFs的募集與活化

正常體內(nèi)成纖維細胞能夠抑制腫瘤細胞的增殖[5]，此外，正常腸成纖維細胞能維持上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)以防止癌變[6]。腫瘤細胞通過分泌趨化因子CXCL12、PDGF、白細胞介素6(IL-6)等各種因子誘導成纖維細胞向CAFs轉(zhuǎn)變[7-8]。實驗發(fā)現(xiàn)，CAFs在被招募和激活后，并不需要誘導因素的持續(xù)存在。這可能是由于在分化過程中，CAFs獲得不可逆轉(zhuǎn)的遺傳和/或表觀遺傳改變，從而達到更穩(wěn)定的活化細胞狀態(tài)[9]。此外，正常的上皮細胞和上皮來源的腫瘤細胞也是CAFs的另一可能來源。有研究表明在慢性炎癥情況下，上皮細胞可通過EMT過程獲得成纖維細胞樣表型并參與纖維基質(zhì)的合成。

有研究者通過建立小鼠消化道腫瘤模型發(fā)現(xiàn)，大部分CAFs來源于骨髓間充質(zhì)干細胞，并通過TGF-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)和CXCL12相互作用的方式被招募至腫瘤部位[10]。因此，CAFs可能是通過趨化因子和其他成纖維細胞因子如TGF-β之間的協(xié)同調(diào)節(jié)作用而被募集。TGF-β是促進成纖維細胞向CAFs轉(zhuǎn)變的重要刺激因素之一。TGF-β通過增加CAFs內(nèi)α-SMA的表達，誘導其增殖、黏附和遷移能力變化，刺激膠原蛋白、ECM酶生長因子、細胞因子和趨化因子的分泌效應，以激活成纖維細胞[3]。

3 CAFs對大腸癌的作用

3.1 CAFs對CRC增殖的作用

腫瘤細胞增殖被認為是腫瘤發(fā)生遷移、侵襲的必要過程。在腫瘤生長過程中，CAFs通過自分泌及旁分泌的方式分泌多種細胞因子和生長因子，如干細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)、表皮生長因子(EGF)、TGF-β、上皮調(diào)節(jié)蛋白及胰島素樣生長因子(IGF)等以促進腫瘤細胞增殖[6，11-12]。

CRC組織中CAFs分泌的HGF，通過激活β-catenin信號通路，進一步誘導腫瘤干細胞的克隆能力，促進CRC細胞增殖。而且HGF能夠修復腫瘤干細胞表型特征，為腫瘤細胞向更高級別分化提供基礎[13]。研究表明，由CAFs產(chǎn)生的TGF-β有助于維持腫瘤細胞微環(huán)境中腫瘤細胞的惡性表型，刺激CRC組織腫瘤上皮細胞增殖。此外，由CAFs產(chǎn)生的趨化因子CXCL12與受體CXCR4結(jié)合后，通過募集血管內(nèi)細胞，促進腫瘤血管新生，刺激CRC細胞增殖。而且這些生長因子對CAFs自身增殖同樣具有促進作用。因此，這些生長因子在CAFs與腫瘤細胞之間形成了一個惡性循環(huán)的反饋效應，最終加速CRC的進展[14-15]。

3.2 CAFs對CRC侵襲及轉(zhuǎn)移的作用

腫瘤微環(huán)境中的CAFs不僅能夠促進CRC細胞增殖，同時可通過腫瘤細胞間的相互作用分泌各種生長因子及趨化因子，進而促進CRC的侵襲及轉(zhuǎn)移。實驗表明，將CRC細胞系與CAFs共培養(yǎng)時，細胞的遷移及克隆形成能力均明顯增加[4]。此外，將CAFs與人CRC細胞聯(lián)合注射到裸鼠體內(nèi)，腫瘤細胞的增殖也顯著增強?；虮倔w論分析進一步揭示了CAFs中過表達的基因與細胞生物學過程，包括發(fā)育(TGFB2、PDGFC、cMET、CADM1、WNT1)和細胞信號轉(zhuǎn)導(TFAP2C、NTF-3、SEMA5A、EFNB2、INHBA)等通路[16]。這些基因產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)CRC細胞的功能，促進CRC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

CAFs可通過細胞之間的相互作用分泌產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)。MMPs不僅可以促進EMT發(fā)生，進而促進癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，還可以導致細胞外基質(zhì)內(nèi)基底膜蛋白水解破壞，改變腫瘤微環(huán)境，增強腫瘤細胞的侵襲能力。此外，CAFs分泌的MMPs可通過裂解表達于腫瘤細胞表面的蛋白酶激活受體1(Proteinase-activated receptor 1，PAR1)，增強腫瘤細胞的侵襲能力。研究表明，CRC細胞與CAFs在腫瘤侵襲過程中發(fā)生相互作用，導致β-連環(huán)蛋白活性增加，從而激活結(jié)腸癌細胞的Wnt信號通路，促進其遷移與轉(zhuǎn)移[17]。

基于腫瘤基因表達譜的分類方法，發(fā)現(xiàn)了一種具有間質(zhì)特征的侵襲性結(jié)腸癌亞型。比較分析高基質(zhì)含量與低基質(zhì)含量的CRC細胞顯示，在高基質(zhì)含量腫瘤組織中的腫瘤細胞表達特定的EMT驅(qū)動因子，包括ZEB2、TWIST1和TWIST2[18]。并且，I型膠原蛋白是這些侵襲性結(jié)腸癌細胞基質(zhì)的主要成分。腫瘤微環(huán)境中，I型膠原蛋白能夠誘導結(jié)腸癌細胞表達腫瘤特異性間質(zhì)基因，抑制肝細胞核因子4基因表達，激活上皮分化轉(zhuǎn)錄，促進CRC細胞侵襲。

腫瘤細胞在發(fā)生轉(zhuǎn)移之前，會在預轉(zhuǎn)移部位形成特殊的微環(huán)境以利于腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。CAFs分泌的細胞因子及其介導細胞外基質(zhì)重塑可以幫助形成適合腫瘤細胞的預轉(zhuǎn)移微環(huán)境。研究表明，S100A4陽性CAFs能夠產(chǎn)生大量VEGF-A[19]。VEGF-A對腫瘤轉(zhuǎn)移部位的血管生成、微環(huán)境建立及轉(zhuǎn)移灶定植具有重要作用。此外，S100A4陽性CAFs產(chǎn)生的肌腱蛋白C能夠激活腫瘤細胞中的Wnt和Notch通路，保護腫瘤細胞避免凋亡。另有研究表明，腫瘤細胞可通過相互作用與周圍的CAFs結(jié)合，發(fā)生共同轉(zhuǎn)移，以利于轉(zhuǎn)移部位腫瘤細胞的生長。

CAFs能激活癌細胞STAT3通路，促進腫瘤進展。CRC常表現(xiàn)為TGF-β通路的突變失活伴隨高轉(zhuǎn)化因子TGF-β的產(chǎn)生。腫瘤細胞中TGF-β能夠刺激CAFs分泌白細胞介素-11(IL-11)，觸發(fā)腫瘤細胞gp130/STAT3信號通路激活[20]。這種方式可以提供具有生存優(yōu)勢的轉(zhuǎn)移細胞，利于腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。綜上，CAFs在CRC的侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

3.3 CAFs對CRC耐藥性的作用

腫瘤細胞的快速增殖是一個極其耗能的過程，無氧糖酵解增加及乳酸堆積是腫瘤細胞能量代謝的一個重要特征。CAFs無氧糖酵解的增強產(chǎn)生大量乳酸，使得腫瘤細胞內(nèi)外環(huán)境酸堿度發(fā)生改變，這一變化影響了藥物在腫瘤中的聚集與藥效的發(fā)揮，并且使腫瘤細胞產(chǎn)生了耐藥性。

由CAFs構(gòu)成的腫瘤細胞外基質(zhì)對癌癥化療具有影響。細胞外基質(zhì)形成了一個天然的物理屏障，因此大多數(shù)抗癌藥物對實體腫瘤的穿透能力有限。此外，癌細胞與ECM結(jié)合后，通過激活PI3K/Akt、ERK和Rho/Rock在內(nèi)的多種生存信號通路而獲得耐藥性[21]。例如小細胞肺癌細胞對ECM的黏附作用賦予其對化療藥物的抵抗力。由于黏附作用激活β整合素刺激的酪氨酸激酶，最終抑制化療藥物誘導的腫瘤細胞凋亡。類似機制在CRC細胞耐藥性產(chǎn)生中也起到一定作用。

除了ECM，CAFs分泌的多種可溶性因子也被證明參與了腫瘤耐藥，如CAFs分泌的趨化因子CXCL12參與介導腫瘤細胞產(chǎn)生對傳統(tǒng)化療藥物的抵抗作用[22]。在CXCR4表達的腫瘤細胞中，CXCL12通過激活黏著斑激酶(FAK)、ERK、β-連環(huán)蛋白等降低腫瘤細胞對于化療藥物的敏感性。實驗證明，將奧沙利鉑或5-氟尿嘧啶處理后的結(jié)腸癌細胞與CAFs共培養(yǎng)，CAFs及其分泌的多種因子可促進CRC細胞的生長和增殖。

CRC啟動細胞(CRC initiating cells，CIC)在細胞自檢中會對常規(guī)化療產(chǎn)生耐藥性，而且CAFs也能夠增加CIC的耐藥性。比較分析CRC患者經(jīng)細胞毒性治療前后的組織樣本，發(fā)現(xiàn)CAFs在經(jīng)過治療后數(shù)量顯著增加。經(jīng)化學藥物治療后，患者體內(nèi)CAFs促進CIC的自我更新，并且體內(nèi)腫瘤的生長也與特異性細胞因子和趨化因子分泌增加有關，如白細胞介素-17A(IL-17A)[14]。CAFs分泌的IL-17A能夠增加CIC的自我更新及侵襲能力。這些數(shù)據(jù)表明，化療藥物通過激活CAFs分泌IL-17A等細胞因子，從而誘導腫瘤微環(huán)境的重塑，增加腫瘤耐藥性。

3.4 CAFs對腫瘤微環(huán)境的作用

炎癥反應被認為與CRC發(fā)生具有密切關系。CAFs作為腫瘤相關炎癥的主要細胞成分，通過誘導依賴性促炎癥基因NF-κB的表達進而介導腫瘤炎癥反應的增強。NF-κB能夠活化增強炎癥趨化因子如CCL2以及環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase 2，COX-2)在CAFs中的表達。CAFs分泌的CCL2能夠介導血管內(nèi)單核細胞募集至腫瘤部位，有利于具有強促癌性的腫瘤相關巨噬細胞生成。同時，COX-2可以產(chǎn)生前列腺素E2，促進惡性結(jié)腸上皮細胞增殖[23]。

CAFs對腫瘤微環(huán)境的另一個顯著影響是它們能夠重塑ECM[24]。CAFs通過分泌I型膠原蛋白，癌胚纖維連接蛋白剪接變異體，骨膜以及透明質(zhì)酸等特定的ECM，促進腫瘤生長。CAFs也可通過分泌賴氨酰氧化酶(Lysyloxidase，LOX)介導I型膠原蛋白的共價交聯(lián)。LOX催化的交聯(lián)反應及腫瘤組織剛性增強都與腫瘤發(fā)生有直接關系。機械應力能夠激活CAFs分泌MMPs，后者能夠調(diào)節(jié)ECM的降解，促進腫瘤細胞的侵襲。

腫瘤微環(huán)境中含有豐富的新生血管，CAFs分泌的MMP一方面通過降解血管內(nèi)皮細胞的基底膜結(jié)構(gòu)，另一方面通過釋放VEGF與細胞外基質(zhì)結(jié)合，最終導致腫瘤新生血管形成。此外，CAFs是趨化因子CXC的重要來源之一，SDF-1/CXCL12能夠?qū)?nèi)皮祖細胞募集至腫瘤細胞處并促進腫瘤新生血管形成。低氧可使CAFs表達缺氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)，從而誘導VEGF表達，促進血管生成[25]。

4 臨床應用

4.1 CAFs與CRC預后的相關性

Huijbers等[26]研究發(fā)現(xiàn)，臨床II期及III期的CRC術(shù)后患者，切除腫瘤組織中含有大量α-SMA陽性CAFs或腫瘤內(nèi)基質(zhì)比例較高的患者，預后往往較差。CAFs產(chǎn)生大量FAP-α和SDF-1/CXCL12，腫瘤內(nèi)高表達的基質(zhì)蛋白FAP-α傾向于更嚴重的疾病進展，并且可能伴有腫瘤的轉(zhuǎn)移或復發(fā)。而且腫瘤內(nèi)FAP-α與SDF-1的高表達也與直腸癌患者新輔助治療后腫瘤復發(fā)有關。

目前可將CRC分為四個分子亞型：CMS1(MSI免疫型)、CMS2(經(jīng)典型)、CMS3(代謝型)及CMS4(間質(zhì)型)。其中，CMS3亞型具有參與基質(zhì)重塑和EMT基因上調(diào)的特征，并且患者預后較差。更詳細的分析表明，對于CRC患者預后情況的預測，主要來自于基質(zhì)細胞表達基因[27]。CAFs可以增加CIC頻率，而且TGF-β通路進一步增強了這種作用。此外，預后不良的CRC，在腫瘤基質(zhì)細胞中顯示TGF-β誘導的基因程序。這些結(jié)果表明，CAF介導的基因表達譜可用于預測結(jié)腸癌患者的預后。

4.2 CAFs在CRC治療中的作用

近年來，隨著對于CAFs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中作用及機制的深入研究，針對CAFs的腫瘤靶向治療也得到了廣泛關注。Kraman等[28]發(fā)現(xiàn)，在小鼠肺癌模型當中，去除FAP陽性細胞會引發(fā)腫瘤免疫反應，致使癌細胞和基質(zhì)細胞快速缺氧壞死。利用FAP特異性抗體治療清除FAP陽性的CAFs，在動物模型上取得了較好的抑制腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移的效果。然而后續(xù)的研究表明，F(xiàn)AP陽性細胞是體內(nèi)卵泡抑素的主要來源，去除FAP陽性細胞會導致肌肉質(zhì)量下降，B淋巴細胞和紅細胞數(shù)量減少。因此，腫瘤組織中FAP陽性細胞耗竭是引起患者貧血及惡病質(zhì)的原因之一[29]。將FAP作為消除CAFs的治療靶點應用于臨床還有待研究。

研究表明，在結(jié)腸癌發(fā)生過程中，CCL3-CCR5軸參與的AOM/DSS通路對于募集和活化CAFs起到重要作用。對小鼠腫瘤模型系統(tǒng)性給予CCR5拮抗劑表達載體，能使腫瘤組織縮小，腫瘤周圍CAFs數(shù)量減少。并且趨化因子CXCL12拮抗劑能抑制CAFs分泌的整合素β1在腫瘤細胞表面聚集，降低胃癌細胞侵襲能力[30]。由此可見，CXCL12/CXCR4信號通路抑制劑在CRC腫瘤治療中具有廣泛前景。

5 小結(jié)與展望

CAFs作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。并且CAFs現(xiàn)已作為癌癥治療的一個重要靶點得到廣泛研究。但是關于CAFs與腫瘤細胞之間相互作用的機制，CAFs促使腫瘤細胞產(chǎn)生免疫耐受及治療抵抗的機制等問題還有待進一步研究。因此，對于CAFs的深入研究，有益于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機制，并為腫瘤治療提供新的研究方向。