范寧寧 耿敬姝

膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制多變且病因復(fù)雜，為尋找膠質(zhì)瘤的有效治療方法帶來了極大的阻礙[1]。MicroRNA-21(miR-21)被證實(shí)在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并通過多個靶點(diǎn)促進(jìn)膠質(zhì)瘤的迅速發(fā)展和惡化[2-3]，意味著miR-21可以作為治療膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)不僅可以作為多種腫瘤的診斷標(biāo)志，還能參與和調(diào)控腫瘤的發(fā)生，然而目前對于LncRNA在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的作用仍知之甚少[4]。最近研究顯示，與正常腦組織相比，LncRNA MEG3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯降低，并且與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后顯著相關(guān)[1]，提示MEG3很可能與膠質(zhì)瘤的惡性發(fā)展相關(guān)。然而，這其中深入的機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。

因此，本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)觀察MEG3和miR-21體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，并且利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染等方法探究了過表達(dá)MEG3與miR-21對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活力與凋亡情況的影響。

1 材料與方法1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

正常人膠質(zhì)細(xì)胞系(NHAs)和人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87)在37℃和5% CO2的培養(yǎng)箱和完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基包含90% DMEM、10%胎牛血清、L-谷氨酰胺2 mM以及100 U/mL的青鏈霉素。

1.2 RT-qPCR

細(xì)胞的總RNA利用Trizol試劑法提取。利用納米分光光度計(jì)ND-100檢測RNA在260～280 nm處吸光度值并計(jì)算濃度。實(shí)驗(yàn)中采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace RT-qPCR RT kit，根據(jù)說明書合成cDNA；RT-qPCR采用試劑盒THUNDERBIRD SYBR RT-qPCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增，qPCR引物見表1。每個待測樣品設(shè)置3個平行復(fù)孔，MEG3以GAPDH作為內(nèi)參照，miR-21以U6作為內(nèi)參照進(jìn)行相對標(biāo)準(zhǔn)化。RT-qPCR在定量PCR反應(yīng)儀ABI 7500 fast Real-Time PCR system上進(jìn)行。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

表1 人LncRNA、mRNA和microRNA的PCR引物序列

1.3 U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染

生物合成過表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-MEG3、陰性對照質(zhì)粒pEGFP-N1、miR-21mimic以及陰性microRNA(miR-NC)。U87細(xì)胞在6孔板上培養(yǎng)24 h后開始轉(zhuǎn)染。采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000并依照試劑說明書的步驟轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞分組：(1)Control組：正常對照，不做任何轉(zhuǎn)染處理；(2)NC組：轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒，作為陰性對照；(3)MEG3組：單純轉(zhuǎn)染pEGFP-MEG3質(zhì)粒；(4)MEG3+miR-NC組：共轉(zhuǎn)染pEGFP-MEG3質(zhì)粒和miR-NC；(5)MEG3+miR-21組：共轉(zhuǎn)染pEGFP-MEG3質(zhì)粒和miR-21；

首先將細(xì)胞在無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 h。然后再配制轉(zhuǎn)染體系：在適量的Opti-MEM培養(yǎng)基中稀釋寡聚物或質(zhì)粒，用無菌槍頭輕輕混勻；同時(shí)將lipo-2000 Transfection Reagent與適量的Opti-MEM輕輕混勻后，在室溫下放置5 min。最后將稀釋的寡聚物或質(zhì)粒和稀釋的lipo-2000 Transfection Reagent混合，在室溫下放置15 min，使其形成穩(wěn)定的復(fù)合物后，將復(fù)合物加入到培養(yǎng)板中，輕輕搖動培養(yǎng)板將其充分混合。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育8 h后，換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)處理。

1.4 CCK-8試驗(yàn)檢測細(xì)胞活力

10 μL CCK-8試劑被加入到100 μL DMEM中混勻后，替換96孔板中待測細(xì)胞、對照細(xì)胞和空白對照孔的原培養(yǎng)液，空白對照孔為無培養(yǎng)細(xì)胞孔。在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞和空白對照2 h后，在酶標(biāo)儀下檢測450 nm下的OD值。被檢測細(xì)胞的相對活力為：被檢測細(xì)胞平均OD值-空白對照孔OD值/對照細(xì)胞平均OD值-空白對照孔OD值×100%。

1.5 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞以1×104個/孔接種于24孔板中。待孵育結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，每孔分別加入200 μL新鮮配制的4%多聚甲醛，室溫孵育30 min。棄去固定液，PBS緩沖液沖洗3次，每次10 min。每孔加入200 μL 3%過氧化氫(甲醇配制)，室溫10 min。待封閉結(jié)束后，PBS緩沖液沖洗3次，每次10 min。然后每孔加入200 μL 0.1% Triton X-100檸檬酸鈉溶液，4℃孵育3 min。再次重復(fù)前面沖洗過程后，棄去PBS緩沖液，每孔加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，37℃避光孵育1 h。PBS緩沖液沖洗3次后，加入200 μL DAPI溶液，37℃孵育15 min。PBS緩沖液沖洗3次后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。TUNEL染色液將細(xì)胞染成綠色，DAPI染色液將細(xì)胞染成藍(lán)色。

1.6 Western blot檢測

按照蛋白分子量要求，采用10% SDS-PAGE凝膠。蛋白按照計(jì)算體積上樣后，首先在70 V電壓下電泳30 min，然后在110 V下電泳至膠底部。電泳停止后，凝膠被取下，進(jìn)行恒流300 mA冰浴轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，在濾過的5%脫脂牛奶室溫?fù)u床上封閉2 h。膜在蛋白一抗中4℃孵育過夜，蛋白一抗包括Pro-caspase-3(1∶1 000稀釋)、Cleaved caspase-3(1∶1 000稀釋)、Bcl-2(1∶500稀釋)、Bax(1∶500稀釋)和GAPDH(1∶1 000稀釋)。TBST洗滌三次后，在熒光山羊抗兔二抗(1∶10 000稀釋)中室溫避光孵育1 h。膜在TBST室溫?fù)u床洗滌三次后，在Odyssey紅外成像儀下檢測和分析目的蛋白條帶印跡灰度值情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 U87細(xì)胞系與NHAs細(xì)胞系MEG3和miR-21的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示U87中MEG3的相對表達(dá)水平為0.26±0.04，與NHAs(1.00±0.26)相比明顯降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A)。同時(shí)U87中miR-21的表達(dá)水平(2.65±0.31)明顯高于NHAs(1.00±0.45)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。

圖1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)MEG3與miR-21的相對含量Figure 1 Relative expression levels of MEG3 and miR-21 in glioma cellsNote：A.The results of RT-qPCR showed that the expression of MEG3 in U87 cells was decreased when compared to NHAs(*P<0.05 vs. NHAs，n=6)；B.The results of RT-qPCR showed that the level of miR-21 expression in U87 cells was higher than that in NHAs(*P<0.05 vs. NHAs，n=6).

2.2 過表達(dá)MEG3對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中miR-21的表達(dá)影響

與NC組相比，MEG3組MEG3的表達(dá)量升高7.87±0.88倍(P<0.001)，說明MEG3過表達(dá)成功(圖2A)。在此基礎(chǔ)上與NC組相比，MEG3組miR-21的表達(dá)量降低0.34±0.05倍(P<0.05)(圖2B)，說明在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)MEG3可明顯下調(diào)miR-21的水平。

圖2 高表達(dá)MEG3下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-21Figure 2 Glioma cells with overexpression of MEG3 downregulated the expression of miR-21Note：A.The results of RT-qPCR verified the successful overexpression of MEG3 in glioma cells(***P<0.001 vs. NC，n=6)；B.The results of RT-qPCR showed that overexpression of MEG3 downregulated the expression of miR-21(*P<0.05 vs. NC，n=6).

2.3 MiR-21逆轉(zhuǎn)MEG3對膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力和凋亡的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MEG3組與NC組相比細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)(圖3A)，提示過表達(dá)MEG3抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力。然而，MEG3+miR-21組與MEG3+miR-NC組相比，U87細(xì)胞活力明顯增加(P<0.01)，表明miR-21能逆轉(zhuǎn)MEG3對U87細(xì)胞活力的抑制作用。進(jìn)一步與NC組相比，MEG3組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，而過表達(dá)MEG3+miR-21后，U87細(xì)胞凋亡數(shù)目較MEG3+miR-NC組明顯減少(圖3B)。以上結(jié)果說明miR-21能夠逆轉(zhuǎn)MEG3對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力的抑制和對凋亡的促進(jìn)。

圖3 miR-21逆轉(zhuǎn)MEG3對膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力和凋亡的影響Figure 3 Effects of miR-21 on cell viability and apoptosis in human glioma cells with overexpression of MEG3Note：A.The cellular viability of U87 cells was measured by CCK-8 assay(*P<0.05 vs. NC，n=6；##P<0.01 vs. pEGFP-N1-MEG3+miR-NC)；B.The apoptosis of U87 cells was detected by TUNEL assay.

2.4 MiR-21逆轉(zhuǎn)MEG3對膠質(zhì)瘤細(xì)胞Bcl-2/Bax下調(diào)和Cleaved caspase-3上調(diào)

MEG3組Cleaved caspase-3/Pro-caspase-3的水平較NC組明顯升高(P<0.05)，而Bcl-2/Bax明顯降低(P<0.01)。然而，MEG3+miR-21組Cleaved caspase-3/Pro-caspase-3的水平較MEG3+miR-NC組明顯降低(P<0.05)，而Bcl-2/Bax明顯升高(P<0.01)(圖4)。以上結(jié)果證明，miR-21能夠逆轉(zhuǎn)MEG3對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞Bcl-2/Bax的下調(diào)和Cleaved caspase-3的上調(diào)，從而削弱MEG3對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的促凋亡作用。

圖4 miR-21減弱MEG3對凋亡相關(guān)蛋白的影響作用Figure 4 miR-21 attenuated the effects of MEG3 on apoptosis related proteins in U87 cellsNote：The expression of cleaved caspase-3/pro-caspase-3 and Bcl-2/Bax ratio was examined in U87 cells by Western blot(* P<0.05 and ** P<0.01 vs. NC；# P<0.05 and ## P<0.01 vs. pEGFP-N1-MEG3+miR-NC，n=6).

3 討論

本研究證明人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中的MEG3的表達(dá)明顯低于正常人膠質(zhì)細(xì)胞系NHAs，相反miR-21在U87中的表達(dá)量卻明顯高于NHAs。過表達(dá)MEG3能夠明顯降低U87的miR-21表達(dá)，抑制U87的活力，降低Bcl-2/Bax水平，提高Cleaved caspase-3含量，促進(jìn)凋亡；相反，共過表達(dá)MEG3和miR-21明顯增加U87的活力，提高Bcl-2/Bax的水平，降低Cleaved caspase-3的含量，抑制凋亡。這些結(jié)果提示我們MEG3不僅是抵抗膠質(zhì)瘤的LncRNA，還為我們提供了將MEG3研發(fā)成為治療膠質(zhì)瘤藥物的重要依據(jù)。

LncRNA可以通過“分子海綿”吸附作用調(diào)節(jié)microRNA從而調(diào)控細(xì)胞活動[5]。如果LncRNA表達(dá)異常，會導(dǎo)致其調(diào)控的microRNA的表達(dá)紊亂，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生發(fā)展。Xiao等發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中LncRNA TP73-AS1異常升高而miR-124異常降低，從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的增殖[6]。Zhao等發(fā)現(xiàn)LncRNA GAS5在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中低表達(dá)而miR-222高表達(dá)，從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤增殖和遷移[7]。研究表明MEG3的低表達(dá)抑制了p53的激活從而促進(jìn)了垂體瘤的生長[8]。而MEG3的低表達(dá)也被預(yù)測與腦膜瘤的惡性發(fā)展相關(guān)[9]。此外，MEG3的低表達(dá)減少了β-連環(huán)蛋白的降解從而能夠促進(jìn)肝癌的發(fā)展[10]。本研究發(fā)現(xiàn)MEG3的表達(dá)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中明顯下降而miR-21明顯升高。這也支持了之前的研究結(jié)果，即MEG3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯降低[1]。已有研究表明MEG3能結(jié)合并調(diào)控miR-21在細(xì)胞內(nèi)的水平和功能[11]。而本研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)MEG3可使miR-21明顯下降。因此，膠質(zhì)瘤中MEG3的異常降低應(yīng)是miR-21異常升高的原因，從而參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)展。

MiR-21的異常增高是促進(jìn)多種癌癥發(fā)展的重要因素。Chai等發(fā)現(xiàn)miR-21通過降低caspase-3和caspase-9表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[2]；Shi等人發(fā)現(xiàn)miR-21通過增加Bcl-2/Bax水平抑制藥物引起的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[12]。因此，有效抑制miR-21的表達(dá)是治療腫瘤的重要途徑。在本研究中，過表達(dá)MEG3可以降低細(xì)胞內(nèi)miR-21的表達(dá)，從而降低Bcl-2/Bax水平和升高caspase-3表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。而這些效果又可以被同時(shí)過表達(dá)MEG3和miR-21所逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，MEG3可以通過抑制miR-21來抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力并促進(jìn)其凋亡。而這也進(jìn)一步支持了之前關(guān)于MEG3通過調(diào)控miR-21發(fā)揮抗腫瘤作用的研究。例如，MEG3可通過調(diào)整miR-21抑制宮頸癌的發(fā)展[13]。

綜上所述，本研究證實(shí)了MEG3通過抑制miR-21抑制膠質(zhì)瘤活力并促進(jìn)其凋亡，這一發(fā)現(xiàn)將有助于尋求更加有效的治療膠質(zhì)瘤的藥物和靶點(diǎn)。