閆 石 霍明鳴 龐 慧 李 焱 蔡 莉

乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其在分子水平上呈現(xiàn)高度異質(zhì)性。根據(jù)2015年St.Gallen國(guó)際專家共識(shí)，HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性乳腺癌被定義為：HER-2過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增，ER和/或PR≥1%[1]。內(nèi)分泌治療在HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性的乳腺癌中占有重要的地位?；A(chǔ)研究表明，HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性患者會(huì)對(duì)他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)發(fā)生原發(fā)耐藥[2]。芳香化酶抑制劑(Aromatase inhibitor，AI)是該類型患者內(nèi)分泌治療的首選藥物，但是，在臨床工作中仍有很多絕經(jīng)后HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者服用TAM，目前關(guān)于預(yù)測(cè)TAM及AI治療療效的研究并不多。近期研究表明，p53蛋白過(guò)表達(dá)能夠預(yù)測(cè)絕經(jīng)后HR陽(yáng)性術(shù)后乳腺癌患者對(duì)AI治療的敏感性[3]。p53基因可以抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)，阻滯細(xì)胞周期及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是目前最重要的抑癌基因之一[4]。本研究分析了p53蛋白表達(dá)對(duì)絕經(jīng)后HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性術(shù)后乳腺癌患者內(nèi)分泌藥物療效的預(yù)測(cè)作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2005年1月—2011年12月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院治療的172例絕經(jīng)后HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性術(shù)后乳腺癌患者的臨床病例資料。患者均為女性，年齡48～75歲，中位年齡56歲，其中有2例患者接受藥物性卵巢去勢(shì)，其他均為絕經(jīng)后患者?；颊咭话闱闆r包括腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、組織學(xué)分級(jí)、病理分期、p53狀態(tài)、ER表達(dá)、PR表達(dá)、是否口服內(nèi)分泌藥物、是否化療、是否放射治療和是否靶向治療，詳細(xì)臨床病理特征見(jiàn)表1?；颊咧杏?4例接受AI治療(AI組)，有88例接受TAM治療(TAM組)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者為乳腺癌根治術(shù)后，免疫組織化學(xué)染色顯示HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性，輔助內(nèi)分泌治療期間規(guī)律服用AI或TAM藥物，Karnofsky行為狀態(tài)評(píng)分≥80分。排除隨訪病例資料不完整者，酗酒、藥物成癮或者精神異常者。所有研究材料均得到患者許可并簽署知情同意書(shū)，且已經(jīng)通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)p53蛋白表達(dá)

172例乳腺癌標(biāo)本經(jīng)免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)癌組織中ER、PR、HER-2、p53蛋白的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由本院2位資深的病理科醫(yī)師分別單獨(dú)判定。免疫組化流程：(1)脫蠟，水化，PBS洗三次；(2)電爐煮沸抗原修復(fù)，冷卻至室溫，PBS洗三次；(3)3%雙氧水室溫下孵育，PBS洗三次；(4)滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min；(5)滴加一抗，室溫靜置30 min。一抗使用抗體分別為ER抗體(ab3577，Abcam，Cambridge，MA，USA，濃度1∶500)，PR抗體(ab2765，Abcam，Cambridge，MA，USA，濃度1∶500)，HER-2抗體(ab16662，Abcam，Cambridge，MA，USA，濃度1∶200)，p53抗體(ab131442，Abcam，Cambridge，MA，USA，濃度1∶200)，4℃冰箱過(guò)夜，PBS洗三次；(6)滴加二抗，室溫靜置30 min，PBS洗三次；(7)滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫下孵育，PBS洗三次；(8)將DAB顯色試劑A、B等量混合，自來(lái)水沖洗10 min；(9)蘇木素復(fù)染10～20 s；(10)脫水、透明、封片、鏡檢。

表1 172例乳腺癌患者的臨床病理特征分析

Note：AI stands for aromatase inhibitor and TAM stands for Tamoxifen.

1.3 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

激素受體(ER、PR)判讀標(biāo)準(zhǔn)[5]：激素受體為腫瘤細(xì)胞核著色，著色細(xì)胞百分比≥1%為陽(yáng)性，<1%為陰性。p53判讀標(biāo)準(zhǔn)[6]：p53著色部位也是細(xì)胞核，癌細(xì)胞核內(nèi)著黃棕色>10%為p53陽(yáng)性，≤10%為陰性。HER-2判讀標(biāo)準(zhǔn)[7]：細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜著棕黃色為HER-2陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比<25%為1+，25%～75%為2+，≥75%為3+，觀察不到著色或著色很弱為陰性。以陰性和1+判斷為HER-2無(wú)擴(kuò)增，3+為HER-2有擴(kuò)增，2+則加做FISH檢測(cè)確定HER-2是否擴(kuò)增。

1.4 隨訪

患者開(kāi)始口服內(nèi)分泌藥物的時(shí)間為隨訪起始時(shí)間，采用查詢電子病歷及結(jié)合電話方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止日期為2016年4月11日。中位隨訪時(shí)間為68個(gè)月(4～131個(gè)月)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用卡方檢驗(yàn)分析p53與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，并運(yùn)用Kaplan-Meier法、Log-rank檢驗(yàn)、Cox回歸模型進(jìn)行生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cox多因素分析變量賦值見(jiàn)表2。

表2 Cox多因素分析變量的賦值表

2 結(jié)果

2.1 p53蛋白表達(dá)與不同臨床病理特征之間的關(guān)系

p53蛋白表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、組織學(xué)分級(jí)、ER及PR表達(dá)均無(wú)關(guān)(P>0.05)(表3)。

表3 172例乳腺癌患者臨床病理特征與p53蛋白表達(dá)之間的關(guān)系

2.2 p53與患者DFS的關(guān)系

應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)狀態(tài)、是否放射治療與乳腺癌患者的DFS有關(guān)(P<0.05)，將兩者納入Cox多因素分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)狀態(tài)是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素(表4)。p53蛋白表達(dá)與乳腺癌患者的DFS無(wú)關(guān)(圖1a)。

表4 172例乳腺癌患者DFS的單因素和多因素分析

Note：AI stands for aromatase inhibitor，TAM for Tamoxifen and DFS for disease-free survival.

2.3 p53在亞組分析中的結(jié)果

亞組分析顯示：口服TAM組患者中，p53陽(yáng)性者的DFS優(yōu)于p53陰性者(圖1b)；口服AI組患者中，p53陰性者DFS優(yōu)于p53陽(yáng)性者(圖1c)。

圖1 p53蛋白表達(dá)與絕經(jīng)后HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性術(shù)后乳腺癌患者無(wú)病生存(DFS)的關(guān)系Figure 1 The relationship between p53 protein expression and disease free survival(DFS)in postmenopausal breast cancer patients with HR-positive and HER-2-positiveNote：A.Comparison of DFS curves between p53-negative and p53-positive in 172 patients with breast cancer(χ2=0.002，P=0.968)；B.Comparison of DFS curves between p53- negative and p53-positive in 88 patients of oral TAM(χ2=4.695，P=0.030)；and C.comparison of DFS curves between p53-negative and p53-positive in 84 patients of oral AI(χ2=5.995，P=0.014).

3 討論

內(nèi)分泌治療在激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者的治療中有著重要地位。有臨床試驗(yàn)表明，對(duì)于絕經(jīng)后早期或者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的內(nèi)分泌治療，第3代AI(阿那曲唑、來(lái)曲唑、依西美坦)的療效優(yōu)于TAM[8]。因此，AI成為絕經(jīng)后乳腺癌患者內(nèi)分泌治療的金標(biāo)準(zhǔn)[9-10]，尤其在絕經(jīng)后的HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性術(shù)后乳腺癌患者中，應(yīng)用AI類藥物內(nèi)分泌治療幾乎成為了一種“習(xí)慣”。盡管基礎(chǔ)研究顯示HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性的患者對(duì)于TAM原發(fā)耐藥[2]，但是，目前在臨床工作中由于患者的經(jīng)濟(jì)條件、藥物的不良反應(yīng)等因素的影響，導(dǎo)致部分絕經(jīng)后患者仍然口服TAM內(nèi)分泌治療。TAM耐藥與HER-2基因表達(dá)狀態(tài)之間的關(guān)系已得到廣泛探討，實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞水平的研究已經(jīng)明確HER-2過(guò)度表達(dá)與TAM耐藥相關(guān)[2]，但在臨床試驗(yàn)研究中并沒(méi)有得出一致性的結(jié)論。近期關(guān)于內(nèi)分泌耐藥機(jī)制的研究很多，但是關(guān)于內(nèi)分泌藥物治療療效的預(yù)測(cè)因素尚未確定[11]。本研究回顧性分析了p53蛋白表達(dá)對(duì)絕經(jīng)后HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性術(shù)后乳腺癌患者的預(yù)后及對(duì)內(nèi)分泌療效的預(yù)測(cè)作用，發(fā)現(xiàn)在絕經(jīng)后HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性術(shù)后乳腺癌患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可以作為乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素，p53蛋白表達(dá)不是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素，并且，亞組分析顯示，在口服TAM組患者中，p53陽(yáng)性者的DFS優(yōu)于p53陰性者(χ2=4.695，P=0.030)，而在口服AI組的患者中，p53陰性者的DFS優(yōu)于p53陽(yáng)性者(χ2=5.995，P=0.014)。由此推測(cè)，p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)是TAM有效治療的預(yù)測(cè)因子，而p53蛋白陰性表達(dá)是AI有效治療的預(yù)測(cè)因子。

關(guān)于p53基因的研究近幾年很多，大約有1/3的乳腺癌患者出現(xiàn)p53基因突變[12]，其突變發(fā)生在腫瘤細(xì)胞核，p53免疫組織化學(xué)染色常用于標(biāo)記其突變狀態(tài)[13]。正常情況下，野生型的p53是抑癌基因，能夠監(jiān)視和控制細(xì)胞基因的完整性，抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，而突變型p53是顯性癌基因，不僅失去了抑制腫瘤的功能，而且能誘發(fā)乳腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和癌變，使癌細(xì)胞無(wú)限的增殖，其陽(yáng)性表達(dá)能夠作為乳腺癌重要的預(yù)后標(biāo)志物和預(yù)測(cè)因子[14-19]。p53在維持基因組穩(wěn)定、控制細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面有著重要的作用[20]，p53可編碼一種核磷酸化蛋白，該蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。p53突變能夠?qū)е缕渌幋a蛋白的功能喪失，失去誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用[21]。李志華等[22]對(duì)乳腺癌組織p53表達(dá)與新輔助化療療效相關(guān)性進(jìn)行的Meta分析也顯示，p53能夠作為乳腺癌新輔助化療療效敏感性的指標(biāo)。Kai等[23]的研究顯示，p53可作為預(yù)測(cè)激素敏感型復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌對(duì)第3代AI耐藥的關(guān)鍵因子。通過(guò)全基因組分析可以發(fā)現(xiàn)p53突變與AI耐藥之間呈顯著正相關(guān)[24]。另有研究結(jié)果顯示，p53蛋白過(guò)表達(dá)能夠預(yù)測(cè)激素受體陽(yáng)性早期絕經(jīng)后乳腺癌對(duì)AI治療的敏感性[4]，這一生物標(biāo)志物可能被用作篩查口服AI患者獲益的一種工具[25]。以上這些研究均表明，p53基因及p53蛋白對(duì)于AI治療的敏感性可能具有一定的預(yù)測(cè)作用。此外，有關(guān)乳腺癌細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，p53表達(dá)與TAM耐藥相關(guān)[26]。目前，關(guān)于p53與TAM治療療效之間的相關(guān)性還有待進(jìn)一步深入研究。

另外，本研究隨訪的是2005年—2011年在本院治療的絕經(jīng)后HR陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者，樣本量較少，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。另外當(dāng)時(shí)抗HER-2靶向藥物價(jià)格昂貴，患者使用率低，存在一些治療局限性。隨著曲妥珠單抗等靶向藥物相繼納入醫(yī)保，越來(lái)越多的患者能夠接受正規(guī)治療，我們期待能分析出更可靠的結(jié)果。

綜上所述，本研究結(jié)果提示p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)是TAM有效治療的預(yù)測(cè)因子，而p53蛋白陰性表達(dá)是AI有效治療的預(yù)測(cè)因子；需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，并且，每一種內(nèi)分泌治療藥物與p53表達(dá)狀態(tài)之間的關(guān)系均值得深入研究，以便進(jìn)一步提高內(nèi)分泌治療療效。