段大鵬 劉珊珊 李偉偉 馮 敏 姬 樂 秦 靜

眾所周知，骨肉瘤又稱成骨肉瘤，是青少年兒童最常見的惡性骨腫瘤，其在早期即可發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，死亡率較高[1-3]。然而，人體骨組織密度大、藥物滲透性差，加上其他復雜的生理生化原因，環(huán)磷酰胺、順鉑、阿霉素等傳統(tǒng)抗腫瘤藥物很難到達患病部位，因此治療效果不佳[4-6]。

有學者發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素(5，7-二羥基-8-甲氧基黃酮，Wogonin)具有特異性誘導腫瘤細胞凋亡、抑制新生血管形成等作用[7-8]。PI3K/Akt信號通路廣泛參與細胞生長、增殖及分化調(diào)節(jié)，在凋亡調(diào)控中具有重要地位，是參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程的重要信號通路之一。漢黃芩素抗腫瘤作用機制涉及了多條重要細胞信號通路[9-10]，然而其對人骨肉瘤MG-63細胞中PI3K/Akt信號通路是否有影響尚未見有文獻報道。本研究基于既往研究，研究漢黃芩素對骨肉瘤MG-63細胞增殖及凋亡的影響，并探討其與PI3K/Akt信號通路之間關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

漢黃芩素由中國食品藥品檢定研究院提供，用PBS溶解后，配制成適合濃度；人骨肉瘤MG-63細胞株購自上海生命科學研究院細胞資源中心；COX-2、Caspase3及p-Akt抗體購自Santa Cruz公司；雙抗購自山東魯抗制藥公司；二甲基亞砜(DMSO)、四氮噻唑鹽(MTT)等購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將液氮中儲存的MG-63細胞取出，放入37℃水浴箱中，溶化后吸出細胞懸液，注入離心管，棄上清后移至培養(yǎng)瓶。DMEM培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素，培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2。在光學顯微鏡下觀察，當細胞貼壁融合度約為80%時傳代，取處于對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 MG-63細胞增殖活性實驗

對數(shù)生長期的MG-63單細胞懸液按組接種于96孔培養(yǎng)板中，分別加入含0、50、100及200 μmol/L漢黃芩素的培養(yǎng)液。分別于24 h、48 h及72 h后加入20 μL MTT，4 h后加DMSO 10 min。采用酶聯(lián)免疫檢測儀測每孔吸光度(OD)值，以空白對照孔OD值調(diào)零，計算細胞生長抑制率。以上實驗均重復3次。

1.4 細胞凋亡實驗

MG-63細胞用0.25%胰酶消化，以105/mL細胞密度接種于細胞培養(yǎng)板中。設(shè)0、50、100及200 μmol/L 4個組別，按組別加入不同濃度漢黃芩素。采用Annexin V/PI雙染色法。胰酶消化后，離心收集細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度。取100 μL細胞懸液分別加500 μL的1×Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC及10 μL PI，反應(yīng)10 min，上流式細胞儀進行分析。

1.5 細胞劃痕實驗檢測MG-63細胞遷移能力

取對數(shù)期生長的MG-63細胞，0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液，以105/mL細胞密度接種于6孔板中。待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，按組別加入不同濃度漢黃芩素(0、50、100、200 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞鋪滿80%時吸出培養(yǎng)液，Marker筆在6孔板背面作標記，移液器槍頭垂直于標記線劃痕，PBS液沖洗3次，去除劃痕處的細胞；24 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞遷移并拍照。

1.6 透射電鏡檢測超微結(jié)構(gòu)

MG-63細胞采用不同濃度漢黃芩素(0、50、100、200 μmol/L)處理后，0.25%胰酶消化，用2.5%戊二醛固定，送西安交通大學醫(yī)學院電鏡室觀察并拍照。

1.7 Western blot法檢測COX-2、Caspase-3及p-Akt蛋白表達

按組別加入不同濃度漢黃芩素(0、50、100、200 μmol/L)至MG-63細胞懸液中，提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度。按《分子克隆實驗指南》所述方法進行SDS-PAGE電泳，電泳至溴酚藍抵達分離膠底部結(jié)束電泳，取下凝膠并作標記，入電轉(zhuǎn)緩沖液平衡5 min后轉(zhuǎn)膜。纖維素膜一側(cè)靠正極，膠一側(cè)靠負極。然后抗原抗體反應(yīng)，并用辣根過氧化物酶化學增強劑顯色反應(yīng)。蛋白的表達水平根據(jù)GAPDH進行標化，通過軟件進行灰度掃描、定量。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩素對人骨肉瘤MG-63細胞增殖的影響

0、50、100、200 μmol/L組在72 h的細胞增殖抑制率分別為3.54±0.09%、20.9±2.33%、28.2±4.01%、47.2±8.11%，50、100、200 μmol/L組與0 μmol/L組相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； 200 μmol/L組細胞增殖抑制率在24 h、48 h、72 h分別為18.2±3.33%、31.4±5.25%、47.2±8.11， 48 h、72 h時與24 h相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

2.2 漢黃芩素對MG-63細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組不同濃度(50、100、200 μmol/L)漢黃芩素處理MG-63細胞后，其凋亡指數(shù)分別為23.98%、36.47%、55.72%，顯著高于對照組(0 μmol/L)的11.43%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。

表1 MG-63細胞生長抑制試驗結(jié)果

Note：*P<0.05，compared with the negative control；#P<0.05，compared with the 24 h group.

圖1 不同濃度漢黃芩素對MG-63細胞凋亡率的影響Figure 1 Wogonin induced apoptosis in MG-63 cells by flow cytometryNote：A，B，C and D stand for 0，50，100 and 200 μmol/L respectively.* P<0.05，compared with the negative control group.

2.3 漢黃芩素對MG-63細胞遷移能力的影響

細胞劃痕實驗提示漢黃芩素對MG-63細胞遷移能力有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性(圖2)。

圖2 MG-63細胞劃痕實驗Figure 2 Wogonin inhibited the ability of migration in MG-63 cells

2.4 漢黃芩素對細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡下觀察，可見漢黃芩素可改變?nèi)斯侨饬鯩G-63細胞超微結(jié)構(gòu)，使細胞體積變小，核固縮，染色質(zhì)邊集，并可見凋亡小體(圖3)。

2.5 漢黃芩素對MG-63細胞COX-2、Caspase-3和p-Akt蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組COX-2和p-Akt蛋白的表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組Caspase-3表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明漢黃芩素可抑制COX-2、p-Akt蛋白的表達，提高Caspase-3在MG-63細胞中的表達水平(圖4)。

圖3 透射電鏡下MG-63細胞超微結(jié)構(gòu)改變(×6000)Figure 3 Ultrastructural changes of MG-63 cells treated with Wogonin

圖4 不同濃度漢黃芩素對MG-63細胞蛋白表達的影響Figure 4 The expression of COX-2，p-Akt and Caspase-3 protein in MG-63 cells treated with wogonin

3 討論

骨肉瘤是常見的原發(fā)性間葉組織腫瘤，近年來發(fā)病率逐年增高[11-12]。骨肉瘤好發(fā)于血運豐富的長骨干骺端，惡性程度高，侵襲性和轉(zhuǎn)移性很強，遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生早，預后較差，死亡率高，嚴重危害青少年兒童的健康和生命[13-15]。Ma等[16]認為，盡管近年來以手術(shù)為主的綜合治療方法取得了很大進展，能暫時控制部分患者病情，但患者的5年存活率仍很低。由于骨組織密度高，滲透性差，大多數(shù)傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物很難進入患病部位，因此研發(fā)新的抗腫瘤藥物十分迫切。

黃芩是祖國傳統(tǒng)中藥，為唇形科黃芩屬，產(chǎn)于遼寧、黑龍江、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅等地，俄羅斯東西伯利亞、蒙古、朝鮮、日本也有分布。漢黃芩素是從傳統(tǒng)中藥黃芩及半枝蓮中分離提取的一種黃酮類化合物。Ge[17]及Wu等[18]試驗研究表明，漢黃芩素具有抗腫瘤作用，可抑制腫瘤的生長，特異性誘導腫瘤細胞凋亡、抑制新生血管形成等作用。漢黃芩素具有來源廣泛、價格低廉、毒副作用少等優(yōu)點，近年來受到越來越多的關(guān)注。本實驗分別用0、50、100、200 μmol/L濃度漢黃芩素作用于MG-63細胞，MTT實驗結(jié)果表明，漢黃芩素可使細胞增殖受到抑制，其細胞增殖抑制率隨著濃度的提高而升高，并且與時間呈正相關(guān)關(guān)系，說明漢黃芩素不僅可以抑制人骨肉瘤增殖，并且具有時間和濃度依賴性。

細胞凋亡受到各種凋亡調(diào)控蛋白的調(diào)控，Caspase蛋白酶家族是細胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵分子群，其中Caspase-3是凋亡執(zhí)行的重要效應(yīng)分子。本研究流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，各組不同濃度漢黃芩素處理MG-63細胞后，其凋亡指數(shù)分別為23.98%、36.47%、55.72%，顯著高于對照組。Western blot結(jié)果進一步發(fā)現(xiàn)，各實驗組Caspase-3表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，表明漢黃芩素可提高Caspase-3在MG-63細胞中的表達水平，進一步誘導MG-63細胞凋亡。這與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致[19]。

PI3K為一個調(diào)節(jié)亞基和一個催化亞基組成的異源二聚體蛋白，其調(diào)節(jié)亞基含有SH2和SH3結(jié)構(gòu)域[20]。Liu等研究認為，血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子等生長因子均對PI3K具有激活作用[21-22]。Lim則證實了PI3K/Akt信號通路廣泛參與細胞生長、增殖及分化調(diào)節(jié)，在凋亡調(diào)控中具有重要地位[23]。Rahmani及Chen的研究均證明PI3K/Akt信號通路是參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程的重要信號通路之一[24]，在許多腫瘤治療中，PI3K/Akt信號通路活化成為抗腫瘤藥物耐藥的關(guān)鍵點[25]。本實驗在證實漢黃芩素抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡作用同時，對其機制作了進一步探討。本研究通過用不同濃度的漢黃芩素作用人骨肉瘤MG-63細胞，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，p-Akt蛋白的表達水平顯著降低，表明漢黃芩素可抑制p-Akt蛋白在MG-63細胞中的表達水平，通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路，從而抑制骨肉瘤細胞生長。

綜上所述，漢黃芩素通過下調(diào)PI3K/Akt信號通路，進而抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖，誘導細胞凋亡。因此，深入開展?jié)h黃芩素抗癌作用的研究將為骨肉瘤的治療帶來新的思路。