李代紅，姚遠，趙一賀（.天津市第一中心醫(yī)院，天津 3009；.北京博富瑞基因診斷技術有限公司，北京 0076）

慢性腎功能衰竭（chronic kidney disease，CRF）是指由各種原因引起腎臟損傷，體積明顯萎縮，且已不能維持腎臟基本功能的病癥。CRF惡化至終末期時被稱為尿毒癥，此時藥物治療已無效，只有通過腎移植才能根治。目前我國有超過100萬名尿毒癥患者，但每年只有1萬名患者可以進行腎移植手術，許多等待或不能進行腎移植手術的患者只能不斷進行血液透析等替代治療來延續(xù)生命，不少患者在等待腎源過程中死亡。面對我國如此稀缺的腎臟資源，如何通過優(yōu)化腎臟資源選取，減少尿毒癥重癥患者腎源的等待時間，提高移植腎存活率，一直是臨床醫(yī)生最為關注的問題。

多年臨床實踐表明，大多數(shù)（＞80%）受體接受具有一個或多個人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）錯配的移植物，其最終失敗與產生針對錯配供體HLA的供體特異性人類白細胞抗原抗體（donor-specific human leukocyte antigenalloantibodies，DSA）相關，其介導各類排斥反應，如超急性排斥反應、急性排斥反應、加速性排斥反應和慢性排斥反應［1-2］。近年來，隨著新型強效免疫抑制劑的臨床運用，腎移植的成功率明顯提高［3］，但由HLA抗體介導的體液免疫排斥反應（antibody-mediated rejection，AMR）仍影響著移植后的人腎存活率。

隨著檢測技術的進步，HLA抗體的檢測已由原來的補體依賴的微量淋巴細胞毒實驗［4］（complement dependent cytotoxicity，CDC）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）［5-6］和流式細胞術［7-8］發(fā)展為現(xiàn)在的基于Luminex平臺的微球分析法［9-10］，對HLA抗體檢測的靈敏性已滿足臨床需求。近年來利用以上方法對受體外周血DSA的檢測可以很好地預測移植后發(fā)生抗體介導的排斥反應和移植腎失功的風險［11-12］，但隨著臨床經驗的積累和免疫學科的不斷發(fā)展，不少學者認為受體DSA水平不能直接代表其免疫狀態(tài)，因為其低估了記憶性B細胞對體液排斥反應的影響［13］。研究表明，當機體對某一蛋白抗原進行免疫響應時，將會同時產生漿細胞和記憶性B細胞。長壽漿細胞可以持續(xù)產生高親和性的抗體結合抗原，給予機體免疫保護，當機體再次遇到相同抗原時，記憶性B細胞可以迅速分化成長壽漿細胞和短壽漿細胞，瞬間增加機體的特異性抗體濃度［14］。在器官移植中，有兩種不同的情況，記憶性B細胞可能起關鍵作用：① 在慢性AMR的情況下，其中持續(xù)活化的記憶性B細胞導致與免疫抑制暴露不足相關的低度但進行性DSA形成，② 在高度致敏的患者中，接受含有先前由宿主識別的同種異體抗原的新移植物，從而觸發(fā)快速且在抗原再次暴露后強烈的繼發(fā)性DSA應答［15］?；谝陨蠗l件，我們發(fā)現(xiàn)供體特異性HLA記憶性B細胞對移植后抗體排斥反應的風險評估、優(yōu)化受體腎源選擇及減少受體等待時間具有重要的臨床意義。

1 國內外研究現(xiàn)狀

1.1 記憶性B細胞的研究進展：免疫記憶是高等脊椎動物獲得性免疫應答的顯著特征。體液免疫應答與細胞免疫應答是免疫記憶的兩大分支。記憶性B細胞是一類具有記憶功能并持續(xù)存在于宿主體內的細胞，由成熟的初始B細胞通過抗原激活分化而來。當記憶性B細胞再次遇到相同抗原時，該細胞可迅速增殖并分化為漿細胞，以此產生高親和力的抗原特異性抗體，介導體液免疫應答，保護機體免受再次入侵抗原的感染［14］。

體液免疫的基本功能是抗體產生和抗體記憶。在感染、接種疫苗或是輸血、妊娠、移植后，通過B細胞受體（B cell receptor，BCR）對外來抗原的識別，成熟的初始B細胞會被激活，并分化為記憶性B細胞和漿細胞，使機體獲得免疫記憶功能［16］。維持機體免疫記憶功能的細胞主要是記憶性B細胞和長壽漿細胞，且這種免疫記憶的維持是不依賴于抗原的［17］。長壽漿細胞定居于骨髓中，能夠分泌抗體，低水平表達或不表達BCR，不能被刺激分化，也不能加速抗體產生。長壽漿細胞在抗原被清除后的一段時間內仍可以持續(xù)釋放高水平的中和性抗體。記憶性B細胞則大部分在外周血中循環(huán)，小部分定居于次級淋巴組織和骨髓中，表達高親和力的BCR，但不自主分泌抗體。研究表明，當機體再次接觸相同抗原時，機體為了更有效清除入侵的非己物質，IgG+B細胞可被快速活化，并增殖分化為產生高滴度、高親和力IgG抗體的分泌型細胞［16］。此外，記憶性B細胞除了分化為漿細胞產生抗體外，還可通過產生細胞因子或提呈抗原給T細胞，抵抗非己物質的入侵［18］。

在初次免疫應答期間，存在兩種不同類型的記憶性B細胞在抗原再激發(fā)過程中表現(xiàn)出不同的功能：IgG+記憶性B細胞優(yōu)先分化成漿母細胞，而IgM+記憶性B細胞增殖更多并進入生發(fā)中心反應［15］。

1.2 記憶性B細胞體外檢測方法的研究進展：如何活化誘導記憶性B細胞在體外增殖是檢測、研究其生理特性首先要面臨的問題。因此，為精確評估HLA抗原特異性記憶B細胞在器官移植中的作用，需探索建立快速有效的B細胞活化方法。

經典的初始B細胞活化途徑包括B細胞與抗原特異性結合以及抗原特異性T、B淋巴細胞的相互識別。但研究表明，記憶性B細胞的功能特性與初始B細胞存在差異，且活化方式也并不一致。因此，非抗原依賴的記憶性B細胞的活化增殖方案成為新的探索方向。研究發(fā)現(xiàn)，非抗原依賴的多克隆刺激劑CpG（cytosine-phosphate-guanine）、PWM（pokeweed mitogen） 和 SAC（staphylococcus aureus cowan）聯(lián)合誘導記憶性B細胞分化為抗體分泌細胞（antibody-secreting cells，ASC）［19］。而對于多種細胞因子的聯(lián)合應用，如CpG + CD40L +IL-2 + IL-10 + IL-15和R848 + IL-2的體外培養(yǎng)模型中，記憶性B細胞則更有效地分化為ASC，并分泌大量的IgM或IgG［20-21］。

目前已有多種使外周血記憶性B細胞增殖分化為ASC并產生相關抗體的成熟體外培養(yǎng)方案。但對于記憶性B細胞的活化卻只是一種非特異性的多克隆激活方式，并分泌多克隆抗體［22-23］。如何從眾多活化的記憶性B細胞中篩選出針對某種抗原的抗原特異性記憶B細胞依然是臨床亟待解決的問題。此前，國外已有不少器官移植相關試驗通過體外表達純化的HLA抗原蛋白或用商業(yè)化的HLAⅠ類位點和Ⅱ類位點抗原混合物為抗原，通過酶聯(lián)免疫斑點試 驗（enzyme linked immunospot，ELISPOT） 檢 測HLA抗原特異性記憶B細胞的含量［24-25］。ELISPOT法測量HLA抗原特異性記憶B細胞雖然靈敏度高，但操作較為繁瑣，耗時較長，且只能檢測患者是否存在HLA 抗原特異性記憶B細胞，并不能明確HLA抗原特異性記憶B細胞的HLA致敏位點。最近，隨著Luminex平臺技術的發(fā)展，HLA抗體檢測試劑盒的不斷成熟，國外已有實驗室用商品化的HLA抗體檢測試劑盒檢測刺激培養(yǎng)后的記憶性B細胞上清中的抗HLA抗體含量［26］。此方法雖然靈敏度不如ELISPOT法，但操作簡單、耗時小，且能準確知道HLA抗原特異性記憶B細胞的HLA致敏位點，現(xiàn)已被國外多家實驗室接受。

但基于Luminex平臺技術和HLA抗體檢測試劑盒（Luminex-single antigen bead，Luminex-SAB）發(fā)展起來的HLA抗原特異性記憶B細胞的檢測仍然存在以下缺陷：① HLA抗體檢測試劑盒中的HLA抗原是體外合成的，未必能反映體內真實的抗原抗體結合反應；② HLA抗體檢測試劑盒只能通過檢測熒光強度大致反映患者由記憶性B細胞分泌出來HLA抗體的多少，既不能非常準確地分析檢測樣品中HLA抗體濃度也不能分析出樣品中HLA抗原特異性記憶B細胞的數(shù)量，遠不能達到定量分析患者體內HLA抗原特異性記憶B細胞的水平，較難作為臨床診斷指標。

隨著記憶性B細胞研究的進一步深入，荷蘭萊頓醫(yī)學院免疫血液及輸血科建立了一種基于ELISPOT的定量檢測供體特異性記憶B細胞的方法［27］。該方法主要通過植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）刺激供體外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），使PBMC持續(xù)分化，細胞中的HLA抗原含量上升，然后通過HLAⅠ類抗體和HLAⅡ類抗體獲取供體HLA抗原。并利用這一供體特異性的HLA抗原與患者的記憶性B細胞進行孵育，最終通過ELISPOT方法定量檢測出患者體內含有供體HLA特異性記憶B細胞的數(shù)量。通過這一方法檢測患者的HLA抗原特異性記憶B細胞，無論是靈敏性、精確性還是可靠性都優(yōu)于Luminex-SAB檢測技術，但因為其要對供體細胞進行數(shù)日的誘導分化，使其在腎移植的臨床運用受到限制，目前只能用于活體移植中。

2 HLA抗原特異性記憶B細胞在腎移植臨床中的應用與前景

記憶性B細胞作為機體體液免疫的重要成員，在器官移植的免疫排斥反應中起到重要作用，國外不少實驗室已開始對HLA抗原特異性記憶B細胞指標在腎移植中的臨床應用進行了研究。

巴塞羅那醫(yī)學院腎臟內科對10例腎移植術后發(fā)生AMR的患者進行回顧性分析發(fā)現(xiàn)［28］，其中5例患者術前外周血群體反應性抗體（panel reactive antibodies，PRA）檢測為陰性，5例患者為可疑陽性。但當他們利用Luminex-SAB方法檢測患者HLA抗原特異性記憶B細胞時發(fā)現(xiàn)，9例患者都顯示為陽性。該回顧性試驗表明，患者外周血HLA抗體含量可能受患者當時免疫狀態(tài)或免疫抑制劑等影響，含量變化較大，其濃度不能等同于患者此時相對應HLA抗原的免疫狀態(tài)。而HLA抗原特異性B細胞作為HLA抗體的上游細胞，能更為準確地預示患者針對于特定HLA位點發(fā)生排斥反應的風險。 進一步對等待移植患者血清HLA抗體和記憶性B細胞的檢測發(fā)現(xiàn)，30.8%（42/136）HLA抗體MFI＜1 500的患者，體內均存有HLA抗原特異性記憶B細胞。

荷蘭萊頓大學醫(yī)學院輸血及免疫科對39例腎移植術前PRA陽性的患者進行分析［26］，研究發(fā)現(xiàn)，抗原特異性記憶B細胞的出現(xiàn)與患者所經歷的免疫事件大小與次數(shù)相關。如只接受過輸血的患者，雖然體內預存有HLA抗體，但只有較少幾率產生HLA抗原特異性記憶B細胞，而只經歷過妊娠或移植的患者，產生HLA抗原特異性記憶B細胞的幾率也不高于60%，但當患者同時經歷過輸血、妊娠及移植，則幾乎必然會產生HLA抗原特異性記憶B細胞。另外，相關的臨床研究表明，利用HLA抗體檢測試劑盒測量患者外周血PRA時，因為入侵物抗原與HLA抗原相近等原因，獲得的假陽性位點較多，不利于腎源選擇，但利用Luminex-SAB法檢測患者HLA抗原特異性記憶B細胞時，出現(xiàn)的HLA陽性位點較少，且HLA陽性位點均具有相同的致敏表位，利于供體腎源的選擇。以上臨床結果對我院腎移植專科的臨床指導意義重大，每年在我院等待腎移植患者中，PRA陽性患者高達100人，這類患者往往等待腎源的時間較長，還有部分PRA高陽性患者因為等待不到合適的腎源而死亡。如果部分PRA陽性患者只單獨接受過輸血，其產生抗原特異性記憶B細胞幾率較少，術前可以只需接受血漿置換或免疫吸附將HLA抗體濃度降低到安全水平即可，不需過分考慮腎源的配對問題，大幅度降低患者等待腎源的時間。但以上結論獲得所依賴的病例數(shù)較少，且外周血PRA檢測陽性而記憶B細胞上清PRA檢測陰性的HLA位點是否會給移植帶來排斥反應的風險，還需要進一步的臨床試驗去驗證。

綜上所述，近幾年來國外多個腎移植實驗室已陸續(xù)開展HLA抗原特異性記憶B細胞相關的臨床試驗。現(xiàn)已表明，抗原特異性記憶B細胞在優(yōu)化腎源選擇，預示術后排斥風險上具有重要的臨床意義。但其研究和運用時間尚短，還需要更多的臨床病例信息明確術后患者產生AMR是否與其預存HLA抗原特異性記憶B細胞相關，明確記憶性B細胞是否在腎移植各階段含量是否穩(wěn)定，是否可以作為一個穩(wěn)定指標指導臨床診斷，明確輸血、妊娠、移植等免疫事件對HLA抗原特異性記憶B細胞產生的關系。最終為我們進一步運用抗原特異性記憶B細胞作為臨床指標提供理論依據(jù)。