陸永佳，張 輝 ，高林林

（1.桐廬縣公安局，浙江 杭州 311500；2.舟山市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 舟山 316021；3.杭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 杭州 310004）

刑事案件中常遇到以糖類為載體的生物檢材，雖然有成功獲取DNA的案例報(bào)道[1]，但由于糖的特殊性，從該類載體上轉(zhuǎn)移、提取DNA一直未見(jiàn)系統(tǒng)研究。本研究以奶糖、硬糖、軟糖3種類型的糖為代表，通過(guò)4種DNA采集方法比較其STR檢出率，以此來(lái)尋求最適合糖類生物檢材上附著脫落細(xì)胞的DNA采集方法。

1 材料與方法

1.1 樣本

采購(gòu)大白兔奶糖（奶糖）、上好佳柑橘味硬糖（硬糖）、桂花牛皮糖（軟糖）各20枚。隨機(jī)選取20名志愿者，每名志愿者對(duì)每種糖進(jìn)行分時(shí)段含嚼，含嚼時(shí)間為30s，在含嚼每種糖之前用礦泉水充分漱口。對(duì)含嚼過(guò)的每枚糖平均分成4份，共制備檢材240份。室溫放置24h后進(jìn)行脫落細(xì)胞采集。

1.2 主要儀器及試劑

4N6FLOQSwabsTM植絨拭子（意大利Copan Flock Technologies公司），脫落細(xì)胞粘取器（15 mm×15 mm，博坤生物科技有限公司），生物物證提取專用棉簽（北京畢思特聯(lián)合科技有限公司），9700型PCR儀、3130xl基因分析儀（美國(guó)AB公司）。Hi-Di甲酰胺溶液、AmpF?STR?Identifiler?Plus試劑盒（美國(guó) AB 公司），15%硅珠懸液、Lysis Buffer裂解液、Elution Buffer洗脫液（美國(guó)Promega公司）。

1.3 方法

1.3.1 脫落細(xì)胞的采集

采用4種方法收集糖類載體上的脫落細(xì)胞。

方法一：生物物證提取專用棉簽兩步擦拭法。先將一根生物物證提取專用棉簽蘸取少量水，使用該微濕的棉簽擦拭糖的表面，再用另一根干的生物物證提取專用棉簽重復(fù)擦拭糖的表面，剪取兩根棉簽，置于1.5mL的微量離心管中。

方法二：脫落細(xì)胞粘取器粘取法。使用大號(hào)脫落細(xì)胞粘取器（15 mm×15 mm）用力粘取糖表面脫落細(xì)胞，將該粘取面置于1.5mL的微量離心管中。

方法三：植絨拭子擦拭法。使用4N6FLOQSwabsTM植絨拭子擦拭糖表面，剪取植絨拭子，置于1.5mL的微量離心管中。

方法四：直接提取法。直接將糖粒放入1.5mL的微量離心管內(nèi)。

1.3.2 DNA的提取

所有檢材均采用改良硅珠法[2]提取，加入Lysis Buffer裂解液400μL，95℃裂解30min，離心后取上清液移入新的離心管內(nèi)，加入15%的硅珠懸液30μL，室溫靜置15min，70%冷乙醇溶液洗滌2次后用Elution Buffer洗脫液，洗脫終體系為30μL。

1.3.3 模板DNA擴(kuò)增

提取的模板DNA使用AmpF?STR?Identifiler?Plus試劑盒擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10μL，其中緩沖液4μL，引物 2 μL，模板 DNA 2 μL，其余用超純水補(bǔ)足。 在9700型PCR儀上擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)按試劑手冊(cè)進(jìn)行。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

取PCR產(chǎn)物 1 μL加入 9 μL混有Liz500的Hi-Di甲酰胺溶液中，在3130xl基因分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。收集的數(shù)據(jù)采用GeneMapper?v3.2分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同采集方法的STR檢驗(yàn)結(jié)果

4種不同的采集方法所獲得的STR數(shù)據(jù)各有差異（表1～4），根據(jù)基因座的檢出情況，將結(jié)果分成完全檢出、部分檢出（檢出基因座為10～14個(gè)）及未檢出3種情況。用直接提取法收集脫落細(xì)胞時(shí)，由于軟糖類檢材在裂解液加熱過(guò)程中變渾濁，無(wú)法離心獲得上清液，故該組檢材無(wú)DNA數(shù)據(jù)。直接提取法的完全檢出率僅為13.3%，植絨拭子擦拭法的完全檢出率則高達(dá)98.3%，生物物證提取專用棉簽兩步擦拭法和脫落細(xì)胞粘取器粘取法的完全檢出率分別為86.7%和66.7%。

表1 生物物證提取專用棉簽STR檢出率比較

表2 脫落細(xì)胞粘取器STR檢出率比較

表3 植絨拭子STR檢出率比較

表4 直接提取STR檢出率比較

2.2 3種不同類型糖的STR檢驗(yàn)結(jié)果

以桂花牛皮糖為代表的軟糖除了直接提取法外，其余3種采集方法的STR檢出率在85%～95%。以大白兔奶糖為代表的奶糖用直接提取法只有少量樣本獲得了STR分型，植絨拭子擦拭法及生物物證提取專用棉簽兩步擦拭法的檢出率均為100%，脫落細(xì)胞粘取器粘取法的檢出率稍有下降。而以上好佳柑橘味硬糖為代表的硬糖，直接提取法的檢驗(yàn)結(jié)果均為陰性，脫落細(xì)胞粘取器粘取法的檢出率也僅僅為30%，生物物證提取專用棉簽兩步擦拭法的成功率可提高到65%，而植絨拭子擦拭法的成功率則為100%。

3 討 論

植絨拭子擦拭法的檢出率最高，在3種類型的60份糖類檢材中僅有1份檢材獲得部分STR分型數(shù)據(jù)，其余均獲成功。究其原因可能與4N6FLOQSwabsTM植絨拭子的結(jié)構(gòu)有非常密切的關(guān)系。4N6FLOQSwabsTM植絨拭子上尼龍纖維結(jié)構(gòu)垂直于基底，在擦拭中不易與糖表面相互黏附，而且其利用專利的棉絨填充技術(shù)最大程度地提高了DNA采集和洗脫效率，DNA的釋放效果更好。

生物物證提取專用棉簽兩步擦拭法和脫落細(xì)胞粘取器粘取法檢出效果相對(duì)較好。糖的配料中一般含有白砂糖、食品添加劑等物質(zhì)，不同類型的糖經(jīng)過(guò)口腔唾液浸潤(rùn)后，表面變得非常黏，糖表面的黏附力影響操作導(dǎo)致部分棉簽纖維黏附于糖表面，因此細(xì)胞收集、轉(zhuǎn)移都不夠充分。由于糖粒一般較小，脫落細(xì)胞粘取器在粘取過(guò)程中與檢材表面無(wú)法完全貼合，具有黏性的糖表面與同樣具有黏性的脫落細(xì)胞粘取器表面存在相互競(jìng)爭(zhēng)的可能。因此，這兩種采集方法獲得的STR檢出率比4N6FLOQSwabsTM植絨拭子都有所下降。

直接提取法效果最差。糖本身容易溶解，使得糖表面附著的口腔上皮脫落細(xì)胞充分被溶解到裂解液中，但由于糖的配料里含有白砂糖、食品添加劑、著色劑等物質(zhì)，其含有的蛋白質(zhì)類、脂類、糖類對(duì)PCR反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用。因此，直接提取法的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他3種方法。

奶糖和軟糖中由于含有果膠或卡拉膠等成分，糖的含量有所降低，糖表面的黏附力不如硬糖高，因此在硬糖中植絨拭子擦拭法相較于其他3種方法檢出率明顯提高。而在奶糖與軟糖中可以選擇價(jià)格相對(duì)低廉的生物物證提取專用棉簽兩步擦拭法。由于糖表面具有黏附力，在用生物物證提取專用棉簽擦拭奶糖與軟糖表面的脫落細(xì)胞時(shí)，可將奶糖或軟糖置于冰箱冷凍片刻，待表面較硬時(shí)再進(jìn)行脫落細(xì)胞的轉(zhuǎn)移操作。

綜上所述，4種不同的采集方法中，直接提取法要直接摒棄，脫落細(xì)胞粘取器粘取法也不太適合應(yīng)用于糖類生物檢材。生物物證提取專用棉簽兩步擦拭法在軟糖與奶糖類的生物檢材中可以選擇使用，而植絨拭子擦拭法對(duì)于糖類檢材均適用，并可取得較好的檢驗(yàn)結(jié)果，但由于植絨拭子本身價(jià)格稍顯昂貴，可針對(duì)性地在陳舊、臟、污染比較嚴(yán)重的疑難糖類載體上進(jìn)行脫落細(xì)胞的采集。

[1]徐偉.奶糖表面提取DNA成功分型1例[J].刑事技術(shù)，2011（5）：47.

[2]高林林，李佑英，葉家喜，等.觸摸檢材DNA的STR檢驗(yàn)[J].刑事技術(shù)，2009（3）：56-57.