(武漢市公安司法鑒定中心,湖北 武漢 430024)
2015年6月1日晚,長江監(jiān)利段“東方之星”客輪發(fā)生特大翻沉事件,遇難者達(dá)442人,受天氣炎熱、打撈工作復(fù)雜等影響,遇難者遺體腐敗很快,心血、肌肉等常規(guī)檢材已經(jīng)無法提取到DNA,如何快速有效地進(jìn)行DNA檢驗對客輪翻沉事件的尸源認(rèn)定具有重要意義。肋軟骨因其相對不易腐敗、易于前處理等特點(diǎn)在腐敗尸體DNA檢驗中成為首選生物檢材[1]。筆者通過對肋軟骨樣品使用GlobalFiler?系統(tǒng)經(jīng)直接擴(kuò)增法檢驗DNA,積累了一些經(jīng)驗,供法醫(yī)同行們參考。
樣本選自“東方之星”客輪翻沉事件遇難者中死亡時間在4~12d的10例高度腐敗遇難者尸體肋軟骨。
GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒(美國AB公司)檢驗組:取上述10份肋軟骨樣本于擴(kuò)增管中,分別加入預(yù)先配制好的GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增體系 25 μL,包括反應(yīng)混合液 7.5 μL、引物混合物2.5μL、去離子水15μL。離心除氣泡后按操作手冊推薦的擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。
GoldeneyeTM20A試劑盒[基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)(北京)有限公司]對照組:取上述10份肋軟骨樣本于擴(kuò)增管中,按照GoldeneyeTM20A試劑盒說明書選取25 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增[2]。
所有樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物在3130xl基因分析儀(美國AB公司)上進(jìn)行電泳,用GeneMapper?ID-X軟件(美國Thermo Fisher Scientific公司)對各原始電泳數(shù)據(jù)進(jìn)行STR基因分析,設(shè)定峰高閾值≥50相對熒光單位(relative fluorescence unit,RFU)作為分析標(biāo)準(zhǔn)。
20份肋軟骨樣本均獲得了全部基因座的分型結(jié)果。經(jīng)GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒得到的10個樣本(編號1~10)的PCR產(chǎn)物,各基因座峰高為(4 826.90±1 591.66)RFU,等位基因雜合子峰高比為0.88±0.02(表1)。 經(jīng)GoldeneyeTM20A 試劑盒得到的10個樣本的PCR產(chǎn)物各基因座峰高為(4425.50±1 276.47)RFU,等位基因雜合子峰高比為0.87±0.03(表 1)。GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒和GoldeneyeTM20A試劑盒在整體峰值高度、各基因座之間平衡性均表現(xiàn)良好。
表1 兩種試劑盒各基因座的檢查結(jié)果
本研究結(jié)果表明,使用GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒直接擴(kuò)增對肋軟骨具有較好的可行性。GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒直接擴(kuò)增法與常規(guī)的提取、擴(kuò)增、電泳流程相比縮短了約3 h,與GoldeneyeTM20A試劑盒相比,擴(kuò)增時間節(jié)省約2 h。同時減少耗材使用,降低了成本,也避免了外源性污染的可能,為及時、準(zhǔn)確地獲得死者身源信息提供了保障。在這類腐敗嚴(yán)重的生物檢材中通常含有較多對PCR產(chǎn)生抑制的物質(zhì)[1],為克服抑制物的影響,Global-Filer?Express PCR擴(kuò)增試劑盒改進(jìn)了PCR所需緩沖液配方,使其能更有效地釋放DNA[2]。GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒具有24個位點(diǎn),其中含10個miniSTR位點(diǎn),對腐敗降解檢材具有更強(qiáng)的抗抑制能力[3]。肋軟骨采用GlobalFiler?Express PCR擴(kuò)增試劑盒直接擴(kuò)增法獲得了良好的基因座分型,并且在整體峰值高度、雜合子平衡性、熒光峰相對熒光強(qiáng)度值在各基因座間平衡性方面均表現(xiàn)良好。同時,國產(chǎn)GoldeneyeTM20A試劑盒也表現(xiàn)不俗,在控制成本上具有一定優(yōu)勢,樣本量大的情況下可節(jié)省開支,實(shí)驗室可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。
[1]竇雪麗,陳紅英,牛蕾蕾,等.PowerPlex?16 HS系統(tǒng)直接擴(kuò)增法檢測肋軟骨[J].刑事技術(shù),2014(5):6-8.
[2]王潔,黃艷梅,張慶霞,等.國產(chǎn)GoldeneyeTM20A試劑盒性能指標(biāo)驗證[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2012,27(1):12-15.
[3]路志勇,薛盧艷,張慶霞,等.GlobalFiler?PCR擴(kuò)增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2015,31(4):273-276.