申 立 ，袁瑞忠 ，卞 杰 ，賀 盟 ，趙子琴

（1.銀川市公安局物證鑒定所，寧夏 銀川 750001；2.崇明縣公安局刑事偵查大隊(duì)，上海 202150；3.上海健康醫(yī)學(xué)院，上海 201318；4.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032）

死亡時(shí)間推斷具有十分重要的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值，是法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，因其受多種因素影響且客觀環(huán)境變化復(fù)雜，也是研究的難點(diǎn)。經(jīng)典的死亡時(shí)間推斷方法有通過死后尸斑變化、體液化學(xué)變化、直腸溫度、昆蟲學(xué)等途徑。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用DNA和蛋白質(zhì)降解規(guī)律來推斷死亡時(shí)間的研究[1-4]也隨之開展。肌原纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）是食品科學(xué)中檢測(cè)肉類尤其是牛肉嫩度的一項(xiàng)指標(biāo)。本研究前期將其用于兔肌肉組織的檢測(cè)以推斷死亡時(shí)間，建立了成熟的實(shí)驗(yàn)方法，得到了良好的相關(guān)性[5]，但運(yùn)用于鑒定實(shí)踐的依據(jù)尚不充足。故本研究擬通過檢測(cè)人體組織中MFI隨時(shí)間的變化規(guī)律，探討MFI在實(shí)際檢案中的運(yùn)用，為死亡時(shí)間推斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

勻漿機(jī)（寧波新芝科技股份有限公司），TGL-16G低溫離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），20目細(xì)胞篩網(wǎng)（上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司），752S紫外分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）。

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（10735094001，上海妍琦生物科技有限公司），雙縮脲試劑（GL1492-QYG，北京百奧萊博科技有限公司），MFI裂解緩沖液（包含100 mmol/L氯化鉀，20 mmol/L磷酸鉀，1 mmol/L EDTA，1mmol/L 氯化鎂，1mmol/L 疊氮化鈉，pH=7.0）。

1.2 樣本選取及分組

本研究共取得10例人體樣本的骨骼肌供研究 （人體樣本由復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系提供，已知死亡時(shí)間或肌肉離體時(shí)間，均已取得家屬知情同意）。人體樣本年齡為（76.5±4.6）歲，男性3例，女性7例。每例均取右肱二頭肌和右股四頭肌，置于室溫［（25±1）℃］下，分別在死后 0、4、8、12、24、36、48、60、72 h 取上述肌組織各0.5g。

1.3 蛋白提取

將上述肌組織投入勻漿機(jī)，加入5mL預(yù)冷的MFI裂解緩沖液勻漿1 min；勻漿后于4℃低溫離心機(jī)中以3000×g離心15min，棄去上清液；加入20mL MFI裂解緩沖液，混勻后重復(fù)離心，棄去上清液；再加入5mL MFI裂解緩沖液后混勻，通過20目細(xì)胞篩網(wǎng)濾去結(jié)締組織碎片，制成蛋白混懸液備用。

1.4 蛋白定量（雙縮脲法）

稱取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品50mg，溶于5mL去離子水，配制成10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，用去離子水補(bǔ)足到 1mL 配制成質(zhì)量濃度為 0、2、4、6、8、10mg/mL蛋白溶液，然后加入4mL雙縮脲試劑，充分混勻，常溫下在暗室中靜置30min。反應(yīng)后應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在540 nm處的吸光度，以蛋白質(zhì)量濃度為自變量（x），吸光度值為因變量（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 MFI值測(cè)定

待測(cè)的樣品蛋白提取液各取0.25mL，加入0.75mL MFI裂解緩沖液稀釋。采用雙縮脲法測(cè)定溶液吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得各樣品蛋白濃度。依照所測(cè)的蛋白濃度，使用MFI裂解緩沖液將每份樣品溶液稀釋成0.5mg/mL。將稀釋后的肌原纖維混懸液充分混勻后倒入比色杯，立即應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其在540nm處的吸光度。以每0.5mg/mL肌原纖維蛋白濃度的吸光度值乘以200來記錄，乘積在20～150，該乘積即為 MFI值[5]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)測(cè)得的MFI數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的MFI進(jìn)行正態(tài)性分析（one-sample Kolmogorov-Smirnov test）；各組間比較運(yùn)用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以死亡時(shí)間為自變量（x），MFI值為因變量（y），進(jìn)行回歸分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 死后不同時(shí)間點(diǎn)各骨骼肌樣本的MFI值

人體死亡以后，隨著時(shí)間的延長，各骨骼肌樣本測(cè)得的MFI值逐漸升高（表1），表明肌原纖維不斷降解并斷裂成小片段。

表1 死后不同時(shí)間點(diǎn)右肱二頭肌和右股四頭肌的MFI值 （n=10，±s）

表1 死后不同時(shí)間點(diǎn)右肱二頭肌和右股四頭肌的MFI值 （n=10，±s）

注：各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布（P＞0.05）；各組間數(shù)據(jù)兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

時(shí)間點(diǎn) 右肱二頭肌 右股四頭肌0h 32.60±2.88 31.60±2.91 4h 45.70±2.41 47.70±2.83 8h 58.40±1.84 60.00±3.09 12h 71.40±2.27 74.10±2.56 24h 93.40±3.27 93.70±3.40 36h 106.80±3.49 110.70±4.57 48h 120.90±2.77 128.20±5.65 60h 130.00±2.62 136.90±6.40 72h 139.90±2.81 144.40±5.36

2.2 數(shù)據(jù)分析結(jié)果

右肱二頭肌組織得到0～72 h的回歸方程為y=46.574+1.439 x（r=0.969 5，P＜0.05）；考慮到檢案實(shí)踐中最有價(jià)值且關(guān)注較多的為12 h以內(nèi)，抽取0～12 h的數(shù)據(jù)建立回歸方程為y=32.660+3.227x（r=0.9879，P＜0.05）。

右股四頭肌組織得到0～72 h的回歸方程為y=47.216+1.524 x（r=0.966 4，P＜0.05）；0～12 h 的回歸方程為 y=32.380+3.495x（r=0.9839，P＜0.05）。

3 討 論

MFI是食品科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)概念[6]，代表肌原纖維蛋白的水解程度，是用來衡量牲畜屠宰并經(jīng)過一段時(shí)間保存后其嫩度的一個(gè)指標(biāo)[7]。機(jī)體死亡以后，組織中腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）逐漸耗盡，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高鈣濃度的鈣泵失去作用，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+外泄，激活蛋白質(zhì)水解酶，從而使得肌原纖維上連接Z盤與I帶、A帶的蛋白發(fā)生降解，原本完整的肌原纖維斷裂成含不同數(shù)目肌節(jié)的小片，因此稱為肌原纖維的小片化[8]。通過對(duì)MFI的測(cè)定，還可以判斷肉類的成熟程度。相關(guān)研究[6]表明，在肉類貯藏成熟過程中，隨著成熟時(shí)間的延長，MFI值逐步升高，而且在早期變化明顯。本課題組前期[5]在家兔肌肉組織研究中發(fā)現(xiàn)，相同蛋白濃度的肌原纖維懸濁液在540 nm處具有不同的吸光度，并隨死亡時(shí)間的延長而增加。因此我們考慮將MFI值引入人體組織死亡時(shí)間的推斷。

前期研究[5]以家兔作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在死亡后24h 內(nèi)，MFI值同死亡時(shí)間相關(guān)性較強(qiáng)（r＝0.961）。 本研究結(jié)果顯示，死后12h內(nèi)MFI值升高較顯著，此后趨于平緩，該結(jié)果與家兔的實(shí)驗(yàn)結(jié)果略有差異，可能是人與兔之間的種屬差異造成的。本研究發(fā)現(xiàn)，MFI值變化從12h變平緩，各時(shí)間點(diǎn)的MFI實(shí)測(cè)值距擬合曲線預(yù)測(cè)值的變異度波動(dòng)更大。兩個(gè)位置的人體骨骼肌，無論是0～12h的線性回歸方程，還是0～72h的線性回歸方程，在本實(shí)驗(yàn)都得到了較好的線性相關(guān)性，其中0～12h的相關(guān)系數(shù)（r）更接近1，說明相關(guān)性更好。這也與文獻(xiàn)報(bào)道[5]的用肌肉降解推斷死亡時(shí)間在早期效果較好的結(jié)論相符合。因此，本研究方法用于死后早期（0～12h）的死亡時(shí)間推斷更為精確。MFI值在死亡12h后變化較平緩，其可能的機(jī)制為：隨著死亡時(shí)間的延長，酶活性不斷減弱直至喪失，對(duì)肌原纖維的消解能力也迅速下降；另一方面，隨時(shí)間延長，肌原纖維也不斷降解，后期都已降解成小片段，達(dá)到一定程度后難以繼續(xù)降解等。因此，后期MFI值變化不大。

在高墜、碎尸等案件中，往往不能獲得完整的尸體，有時(shí)僅有殘缺不全的骨骼或肌肉組織，使死亡時(shí)間推斷工作面臨較大困難。在利用肌肉組織推斷死亡時(shí)間方面，學(xué)者們也嘗試了多種方法：有學(xué)者[9]通過大鼠死后肌肉組織中微生物ATP降解速度來研究死亡時(shí)間，有學(xué)者[10]根據(jù)肌肉、軟組織的生物力學(xué)性狀推斷死亡時(shí)間，也有基于食品科學(xué)領(lǐng)域肉類新鮮程度的檢測(cè)原理，根據(jù)肌肉浸漬液在不同時(shí)段的電導(dǎo)率變化來研究死亡時(shí)間[11]。然而，上述研究均局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果與人體組織應(yīng)用方面尚有一段距離。本實(shí)驗(yàn)將MFI值的檢測(cè)運(yùn)用于人體組織，并取得了滿意的結(jié)果，為其在法醫(yī)學(xué)實(shí)際檢案工作中的運(yùn)用提供了較為可靠的依據(jù)，豐富了法醫(yī)學(xué)早期死亡時(shí)間推斷的研究內(nèi)容。

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