李 莉 陸小凡 趙煥英 計云霞 劉利鋒 粟 斌

(艾滋病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京 100069)

伴隨CAR-T細(xì)胞療法獲得FDA批準(zhǔn)正式上市以來，足以改變癌癥治療模式的過繼免疫治療(AIT)成為人們持續(xù)關(guān)注的熱點(diǎn)。AIT目前大多采用分化終末期的效應(yīng)T細(xì)胞，而且其療效與過繼轉(zhuǎn)移T細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)。研究表明中晚期T細(xì)胞回輸后，其擴(kuò)增及存活能力均不如早期T細(xì)胞，例如Klebanoff等〔1〕觀察了中心記憶型T細(xì)胞(TCM)和效應(yīng)型T細(xì)胞(TEM)分別輸注于接種腫瘤細(xì)胞的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)TCM比TEM具有更持久的存活時長和更好的抗腫瘤效果。究其原因，TCM較TEM具有自我更新和分化為效應(yīng)細(xì)胞的能力。那么，新近發(fā)現(xiàn)的干性記憶型T細(xì)胞(TSCM)，它們具有更強(qiáng)的增殖和自我更新能力，可能成為T細(xì)胞過繼性免疫治療一個新的亮點(diǎn)。

1 TSCM的表型及功能特點(diǎn)

1.1TSCM的發(fā)現(xiàn) 根據(jù)細(xì)胞表面淋巴結(jié)歸巢標(biāo)志(CCR7或CD62L)和蛋白酪氨酸磷酸酶CD45(CD45RA或CD45RO)的表達(dá)，記憶型T細(xì)胞可分為TCM、TEM〔2,3〕。以往研究認(rèn)為，記憶型T細(xì)胞由初始T細(xì)胞在受到抗原刺激時分化產(chǎn)生，經(jīng)由TCM，最終分化為TEM，但在2005年，美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院Zhang等〔4〕在研究小鼠移植物抗宿主反應(yīng)疾病(GVHD)時發(fā)現(xiàn)一群低表達(dá)CD44(CD44lo),高表達(dá)CD62Lhi及干細(xì)胞抗原,同時表達(dá)Bcl-2，CD122(IL-2和IL-15受體)的CD8+T細(xì)胞，這群細(xì)胞具有干細(xì)胞樣的特點(diǎn)，被命名為“TSCM”。在2009年，Gattinoni等〔5〕在小鼠身上進(jìn)一步證實(shí)了這群細(xì)胞的存在。直到2011年，這一個新的記憶型T淋巴細(xì)胞亞群在人類外周血中被Gattinoni等〔6〕發(fā)現(xiàn)，因此，由于TSCM亞群的發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的T細(xì)胞分化模式被打破，T細(xì)胞分化模式改變?yōu)椋撼跏糡細(xì)胞→TSCM→TCM→TEM。致此，TSCM被認(rèn)為是最早期分化的，存在時間最長的記憶型T細(xì)胞。

1.2TSCM的表型特征 TSCM存在于小鼠、靈長類動物及人類。在人類外周血中，約占CD4+或CD8+T細(xì)胞的2%～4%，歸巢于淋巴結(jié)。TSCM與初始T細(xì)胞具有相似的細(xì)胞表型，均具有CD45RA+CD45RO-CCR7+CD27+，但是，與初始T細(xì)胞不同的是，TSCM高表達(dá)CD95和CD122(IL-2Rβ)(兩者均為TCM和TEM所表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)志)。人類TSCM還高表達(dá)BCL-2、CXCR3、CXCR4、LFA-1等T細(xì)胞分化標(biāo)志物，而低表達(dá)CD38和CD31。

1.3TSCM的功能特征

1.3.1有分泌細(xì)胞因子的能力 TSCM具有與TCM和TEM相似的特性，即當(dāng)再次遇到抗原刺激時，記憶型T細(xì)胞能夠快速反應(yīng)，發(fā)揮其效應(yīng)功能。Gattinoni等〔6〕發(fā)現(xiàn)：CD8+TSCM細(xì)胞在抗CD3/CD28/CD2等多克隆刺激下，可以分泌腫瘤壞死因子(TNF-α)、干擾素(IFN)-γ和白細(xì)胞介素(IL)-2等細(xì)胞因子，而初始T細(xì)胞則不具有這些特性，當(dāng)再次遇到抗原刺激時保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

1.3.2具有自我更新和多能分化的潛能 研究表明〔6〕：CD8+TSCM在IL-15存在下，連續(xù)培養(yǎng)10 d，約有60%的TSCM細(xì)胞保持CD45RA+的特征，即CD45RA+CD45RO-CCR7+CD62L+，而TCM僅有30%保持原細(xì)胞表型，即CD45RA+CD45RO+CCR7+CD62L+，因此，TSCM細(xì)胞比TCM細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新的能力。同時還證實(shí)TSCM在抗CD3/CD28/CD2等多克隆刺激下，部分TSCM細(xì)胞逐漸表現(xiàn)為CD45RO表達(dá)上調(diào)，CD62L和CCR7的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步分化為TCM和TEM。TCM約占TSCM子代的50%,TEM約占4%，約有15%的TSCM細(xì)胞保持母代表型特征。Cieri等〔7〕觀察TSCM在人骨髓移植的分化情況時，亦證實(shí)了TSCM可以進(jìn)一步分化為TCM和TEM。所以，與TCM和TEM相比，TSCM具有再生、多能分化等干細(xì)胞特性，具有產(chǎn)生所有記憶型T細(xì)胞的能力。Klebanoff等〔8〕的研究亦證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)：將不同的T細(xì)胞亞群對小鼠進(jìn)行輸注，以腫瘤的縮減程度作為評判指標(biāo)，T細(xì)胞分化程度和抗腫瘤效果之間存在著明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即分化程度越低的T細(xì)胞亞群，其抗腫瘤效果越強(qiáng)大，TSCM>TCM>TEM。

1.3.3具有增殖能力 一個CD8+TSCM在IL-15存在的培養(yǎng)基中可以快速分裂成2個子細(xì)胞，其中，一個子細(xì)胞保持原母代細(xì)胞特性，另一個子細(xì)胞進(jìn)一步向下分化為其他類型的T細(xì)胞(包括TCM和TEM等)。CD4+TSCM在IL-7的存在下具有相似的增殖能力〔9〕，因此，TSCM一部分保持靜息狀態(tài)，具有進(jìn)一步增殖及分化的潛能。

2 TSCM與抗腫瘤作用及機(jī)體免疫

2.1TSCM的抗腫瘤作用 在小鼠的在體實(shí)驗(yàn)中，TSCM與其他類型的T細(xì)胞相比，具有自我更新的能力及更強(qiáng)的抗腫瘤能力〔5,6,10〕。這些特性的具備，使得TSCM療法可以克服現(xiàn)有的免疫治療缺點(diǎn)，如T細(xì)胞植入低下、持久性差及不能形成長久的免疫反應(yīng)等。

Gattinoni等〔5〕證實(shí)，TSCM在小鼠腹腔過繼性T細(xì)胞治療的第二次診療中，可以分化成TCM和TEM亞群。Cieri等〔10〕證實(shí)在移植物抗宿主病小鼠模型中，TSCM被證實(shí)在淋巴結(jié)及非淋巴組織中，均具有植入、增殖等能力，且是初始細(xì)胞和TCM的10～100倍。值得注意的是，TEM已被用于臨床試驗(yàn)中，但植入體的增殖及存活能力較差，無法在體內(nèi)維持長時間的免疫應(yīng)答。在NSG小鼠模型中，TSCM較初始T細(xì)胞和T細(xì)胞其他亞群更具自我復(fù)制和存活能力。

T細(xì)胞的增殖和存活能力與過繼性T細(xì)胞治療的抗腫瘤效率密切相關(guān)〔6〕。T細(xì)胞受體(TCR) 或嵌合抗原受體(CAR)基因工程是目前臨床應(yīng)用的針對靶標(biāo)的特異性循環(huán)T細(xì)胞的技術(shù)。Gattinoni等〔6〕應(yīng)用這一技術(shù)制備針對間皮素特異的記憶型T細(xì)胞的各亞群，以檢測對于腫瘤模型的抵抗作用。間皮素特異TSCM、TCM、TEM細(xì)胞注射入嚴(yán)重免疫缺陷小鼠(NSG小鼠)的腹腔內(nèi)。發(fā)現(xiàn)TEM介導(dǎo)的抗腫瘤能力最差，并伴有腹水等癥狀，與對照組相比，小鼠的生存率未見明顯改觀；TCM治療較TEM治療有效，提高了小鼠的生存率，但在治療后的40 d內(nèi)，小鼠均死于腫瘤的進(jìn)展。與此明顯相反的是，TSCM細(xì)胞在小鼠體內(nèi)激發(fā)對腫瘤的抑制，除部分小鼠(2只)在2～3 w內(nèi)死亡外，其余小鼠(6只)獲得治愈或腫瘤明顯縮小。移植TSCM細(xì)胞造成的小鼠晚期死亡的原因主要是由于移植物抗宿主反應(yīng)所致的體重下降。由此可見，在小鼠模型中，過繼性TSCM細(xì)胞治療較TCM 和TEM細(xì)胞治療具有更強(qiáng)的抗腫瘤能力和更好的治療效果。而對骨髓移植患者的治療研究發(fā)現(xiàn)，以TSCM為靶點(diǎn)的T細(xì)胞治療方案可能具有比TCM和TEM更安全、有效的治療效果〔11〕。在血液腫瘤中，TSCM細(xì)胞被認(rèn)為是免疫記憶的決定因素之一，監(jiān)測TSCM細(xì)胞的水平對血液腫瘤骨髓移植后的預(yù)后有重要意義〔12〕。

2.2TSCM與機(jī)體免疫 TSCM細(xì)胞在維持機(jī)體細(xì)胞免疫功能中亦具有重要作用〔13〕。長期的抗病毒治療過程中，人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV)特異性CD8+TSCM介導(dǎo)的CTL反應(yīng)有助于機(jī)體產(chǎn)生持久的體液免疫反應(yīng)〔14〕。HIV慢性期感染患者CD8+TSCM細(xì)胞與疾病進(jìn)展具有一定的相關(guān)性〔15〕。另外，TSCM細(xì)胞在其他感染性疾病中也充分顯示了其在機(jī)體細(xì)胞免疫中的作用。對41種黃熱病毒減毒疫苗的研究發(fā)現(xiàn)，黃熱病毒特異性CD8+TSCM細(xì)胞可以穩(wěn)定存在25年以上且仍具有再生能力〔16〕，由此可見，與TCM和TEM細(xì)胞相比，TSCM細(xì)胞具有更強(qiáng)的再生、抗病毒和抗腫瘤能力。然而，CD4+TSCM細(xì)胞極易被HIV病毒感染，其胞內(nèi)HIV-1DNA含量雖不是最高，隨著HIV治療時間的延長，CD4+TSCM細(xì)胞逐漸成為HIV病毒貯存庫的主要成員〔17,18〕，因此，檢測HIV感染的CD4+TSCM細(xì)胞水平成為有效控制HIV感染的重要評價指標(biāo)之一。

2.3TSCM細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的潛能 有兩個基因治療的臨床試驗(yàn)對TSCM細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的可能性進(jìn)行了探索，這些臨床試驗(yàn)均以在體長時程T細(xì)胞改造為特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)者追蹤了接受基因治療者的1 700個T細(xì)胞克隆的命運(yùn)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)TSCM細(xì)胞在基因改造的干細(xì)胞融合后保持存在長達(dá)12年之久，對TSCM細(xì)胞的安全、功能、生存期等的驗(yàn)證，均說明了其具有臨床應(yīng)用的潛能〔11〕。Sabatino等〔19〕進(jìn)行了臨床級別的CD-19特異的CAR修飾的CD8+TSCM細(xì)胞治療B細(xì)胞惡性腫瘤的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明，CD19-CAR 修飾的CD8+TSCM 顯示更強(qiáng)的代謝適應(yīng)性，對急性淋巴細(xì)胞白血病移植瘤具有持久的抗腫瘤反應(yīng)且反應(yīng)穩(wěn)定，這一實(shí)驗(yàn)為一期臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

雖然臨床前動物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)TSCM細(xì)胞具有非常有效的抗腫瘤的作用〔5,6〕，但是，過繼性TSCM細(xì)胞治療距離臨床應(yīng)用尚有很長的路要走，需要跨過的障礙之一就是如何擴(kuò)增得到足夠數(shù)量的TSCM細(xì)胞，這方面的研究正方興未艾。Cieri等〔10〕和Gattinoni等〔6〕分別用IL-7/IL-15 、Wnt/β-catenin通路中糖原合成 (GSK)-3β的抑制劑TWSl19聯(lián)合IL-7/IL-21對體外人TSCM進(jìn)行擴(kuò)增，取得較好的效果；van der Waart等〔20〕干擾Akt信號通路獲得具有MiHA-特異性、CCR7+CD62L+早期記憶型CD8+T細(xì)胞。我國在這方面也做了初步嘗試，馬星如等〔21〕用生長分化因子11(GDF11)對CD8+T細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增，隨著CD8+T 細(xì)胞數(shù)量的增加，相應(yīng)的TSCM細(xì)胞數(shù)量也隨之顯著地增加，并在培養(yǎng)的第3周達(dá)到增殖高峰。這些有效的嘗試，為TSCM細(xì)胞盡快應(yīng)用于臨床抗病毒和抗腫瘤的過繼型性免疫治療，提供了新的可行的技術(shù)手段和方法。

TSCM具有干細(xì)胞的特性，自我更新和進(jìn)一步分化的能力。Biasco等〔11〕首次證實(shí)用于基因治療的TSCM細(xì)胞是安全的，并具有持續(xù)性存活能力。隨著TSCM體外擴(kuò)增的技術(shù)和方法的成熟，以及CAR-T細(xì)胞療法在國外臨床應(yīng)用及我國這方面的初步的嘗試，基于TSCM的特點(diǎn)，將其應(yīng)用過繼性免疫細(xì)胞治療，及基于CART技術(shù)將其應(yīng)用于腫瘤治療，將指日可待，從而開啟免疫治療及腫瘤治療的新的篇章。