（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林長春 130033）

目前，我國畜牧業(yè)正由粗放型向集約化轉(zhuǎn)變的過程中，尤其是肉羊養(yǎng)殖業(yè)正經(jīng)歷重大的飼養(yǎng)管理方式變革，對精細(xì)化和生態(tài)化飼養(yǎng)管理技術(shù)的需求十分迫切，加之我國對環(huán)境保護(hù)越來越重視，已經(jīng)成為我國的基本國策。通過營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)實現(xiàn)肉羊養(yǎng)殖的低碳生產(chǎn)，不僅符合我國國民經(jīng)濟(jì)和現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展的方向，而且契合我國現(xiàn)階段肉羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的技術(shù)需求。甲烷是一種生物源性溫室氣體，其溫室效應(yīng)是二氧化碳的23倍。反芻動物瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的甲烷是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最主要的溫室氣體來源，成為影響氣候變化的重要影響因素，不但造成飼料資源的巨大浪費，還對生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的威脅[1-3]。因此，反芻家畜甲烷代謝調(diào)控已成為畜牧領(lǐng)域研究的熱點之一，具有環(huán)境和經(jīng)濟(jì)的雙重效應(yīng)。

反芻動物瘤胃中產(chǎn)生的甲烷主要來源于日糧中碳水化合物（CHO）的降解過程。日糧中的有機物在瘤胃中被微生物分解，產(chǎn)生氫氣（H2）和含有甲基的初級發(fā)酵產(chǎn)物（如甲酸、甲胺、甲醇和乙酸等），產(chǎn)甲烷菌可以將這些初級發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為甲烷，并以此獲得生命活動所需的能量。H2還原CO2是瘤胃中甲烷產(chǎn)生的主要途徑，而甲酸是僅次于H2和CO2的甲烷生成底物。瘤胃中產(chǎn)生甲烷的生化反應(yīng)機制有CO2-H2還原途徑、甲酸、乙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸（VFA）分解途徑以及甲醇等甲基化合物分解途徑，其中CO2-H2還原途徑是瘤胃中甲烷產(chǎn)生的主要來源，所產(chǎn)甲烷占反芻動物甲烷總產(chǎn)量的80%以上。反芻動物甲烷排放量主要受日糧組成的影響，與纖維含量密切相關(guān)，當(dāng)日糧中纖維含量增加時，刺激纖維素分解菌增殖，瘤胃主要進(jìn)行乙酸發(fā)酵，產(chǎn)生大量H2，從而促進(jìn)產(chǎn)甲烷菌大量增殖，導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量增加。瘤胃內(nèi)甲烷的產(chǎn)生同時受到日糧中氮源的影響。瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成需要日糧提供所需的碳源和氮源，滿足對兩者的需要，才能達(dá)到微生物的最佳產(chǎn)量。目前，國際上反芻動物甲烷減排的營養(yǎng)調(diào)控措施包括：日糧組成調(diào)控、生物學(xué)調(diào)控、電子傳遞調(diào)控、植物提取物調(diào)控等幾種主流調(diào)控方式，其中除日糧組成調(diào)控外其余措施均可通過在日糧中使用不同類型的添加劑從而達(dá)到減低甲烷排放量提高瘤胃發(fā)酵功能的目的[4、5、6]。本試驗以羊草作為試驗動物主要飼料原料，采用吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主研發(fā) “六通路瞬時發(fā)酵微量產(chǎn)氣全自動記錄裝置與軟件系統(tǒng)”，對五種飼料添加劑對甲烷作用效果和瘤胃發(fā)酵功能進(jìn)行對比，以期獲得適宜在肉羊生產(chǎn)中應(yīng)用推廣的甲烷抑制劑。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用羊草采自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院肉羊養(yǎng)殖現(xiàn)場，營養(yǎng)成分如下：干物質(zhì)88.31%、粗蛋白9.89%，中性洗滌纖維30.87%，粗脂肪2.76%，粗灰分4.81%，能量19.12kJ/g。莫能菌素純度99%，規(guī)格2000萬單位；活性炭，黑色顆粒狀，粉碎后用40目篩網(wǎng)過濾；綠茶提取物（純度90%，茶多酚20%-98%）；酵素，枯草芽孢桿菌（≥3*108cfu/ml）、釀酒酵母菌（≥2*108cfu/ml）植物乳桿菌克（≥2*108cfu/ml）；硝酸鈉（純度99%，分析純）。

1.2 供試動物及瘤胃液的采集

在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院選用3頭裝有永久性瘤胃瘺管的東北肉羊為試驗動物。試驗羊以羊草作為唯一飼料來源，取瘤胃液前預(yù)飼期7d，每天飼喂2次（6：00和18：00），自由飲水。于每日晨飼后兩小時（8：00）抽取瘤胃液，混合后裝于保溫瓶中帶回實驗室，用4層紗布過濾，同時通入氮氣。試驗過程中發(fā)酵裝置始終保持39±0.1℃，緩沖液pH值6.8。

1.3 體外發(fā)酵

體外發(fā)酵裝置采用吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院自主研制的“六通路瞬時發(fā)酵微量產(chǎn)氣全自動記錄裝置與軟件系統(tǒng)”（圖1）。稱1.5g羊草作為發(fā)酵底物與相應(yīng)的添加劑，提前放入6個容積為300ml的白鋼發(fā)酵罐內(nèi)，每個發(fā)酵罐提前預(yù)熱并通入氮氣，溫度達(dá)到39℃后各發(fā)酵罐中裝入50ml瘤胃液，并加入100ml人工唾液原液。發(fā)酵罐密封后放入恒溫水浴搖床內(nèi)（頻率為85次/分）。數(shù)據(jù)采集儀器每間隔1min，依次（A-F）單獨采集各發(fā)酵罐內(nèi)氣體數(shù)據(jù)，每6min循環(huán)一次，分析儀為集成一體機，利用單獨的甲烷（德國SENSORSEUROPE公司）、二氧化碳（德國SENSORSEUROPE公司）、氧氣（美國AMI公司）和氫氣（英國CITY公司）濃度傳感器對氣體進(jìn)行檢測。

圖1 六通路瞬時發(fā)酵微量產(chǎn)氣全自動記錄裝置與軟件系統(tǒng)

1.4 試驗設(shè)計

試驗采用完全隨機化設(shè)計，發(fā)酵罐內(nèi)的循環(huán)時間間隔為1min，試驗重復(fù)5次，每次試驗連續(xù)發(fā)酵12h。各添加劑的添加量為底物（羊草）的2%，因不同添加劑有純度差異，使各添加量有所不同，具體如下：莫能菌素30mg，綠茶提取物35mg，硝酸鈉45mg，活性炭40mg，酵素110mg，對照組無添加劑。

1.5 樣品采集及分析

甲烷、二氧化碳和氫氣產(chǎn)量由數(shù)據(jù)分析儀采集并直接記錄。發(fā)酵12h后將發(fā)酵液用4層紗布過濾，按發(fā)酵液相應(yīng)的比例加入25%的偏磷酸，混合后用10000×g離心10min，之后于-20℃冷凍保存，用于揮發(fā)性脂肪酸（VFA）測定，VFA用氣相色譜外標(biāo)法測定，發(fā)酵結(jié)束后立即用pH計測定各發(fā)酵罐中發(fā)酵液的pH值。

1.6 統(tǒng)計分析

使用Excel 2007進(jìn)行初步整理，采用spss 19軟件中的MIXED模型進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯著水平為P＜0.05，并采用Duncan方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 添加劑對肉羊體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

由表1可知，硝酸鈉和莫能菌素組對甲烷產(chǎn)生量的抑制效果最為顯著（P＜0.05），分別下降了28.49%和16.42%。活性炭、綠茶提取物對甲烷產(chǎn)量的影響并不顯著（P﹥0.05）。酵素組與對照組相比甲烷產(chǎn)生量提高了3.7%。二氧化碳排放量硝酸鈉顯著高于對照組和莫能菌素（P＜0.05），綠茶提取物和酵素與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。氫氣產(chǎn)生量硝酸鈉和綠茶提取物，顯著高于對照組和莫能菌素（P＜0.05）。

2.2 添加劑對肉羊瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸的影響

由表2可知，對照組和五種添加劑乙酸、丙酸、丁酸濃度均發(fā)酵后均顯著高于發(fā)酵前（P＜0.05）。五種添加劑和對照組相比乙酸、丙酸、丁酸濃度均未達(dá)到顯著水平（P﹥0.05）。

3 討論

3.1 硝酸鹽

已有研究報道：硝酸鹽類物質(zhì)可作為非蛋白類氮源促進(jìn)反芻動物瘤胃發(fā)酵功能。反芻動物瘤胃內(nèi)甲烷的產(chǎn)生，主要依靠4H2+HCO3-+H+→CH4+3H2O的還原途徑，是消耗瘤胃內(nèi)多H2的重要途徑。硝酸鹽類物質(zhì)進(jìn)入瘤胃后，首先被還原成亞硝酸鹽再被還原為氨，在這一過程中需消耗瘤胃內(nèi)部分 H2，同時硝酸根離子具有較強氧化性，與甲烷菌 CO2-H2的還原途徑相比更有利于被 H2還原。Amlan[7]和趙麗萍[8]等研究認(rèn)為：合理計量的硝酸鹽類物質(zhì)進(jìn)入瘤胃后作為電子受體，可有效降低甲烷排放量。本研究中以羊草為發(fā)酵底物，添加2%的硝酸鹽后甲烷排放量降低了28.49%，與對照組相比僅丙酸濃度有下降趨勢，但未達(dá)顯著水平，說明硝酸鹽未損害瘤胃發(fā)酵功能，與上述研究結(jié)果相一致。但硝酸鹽作為電子受體，如短時間大量進(jìn)入反芻瘤胃后，轉(zhuǎn)化過程中如亞硝酸鹽含量超過了微生物將其轉(zhuǎn)化為氨的能力時，就會造成亞硝酸鹽中毒，所以使用時必須嚴(yán)格控制添加計量，這也在一定程度上限制了硝酸鹽在肉羊生產(chǎn)中的使用和推廣。

3.2 莫能菌素

眾多研究表明[9、10]莫能菌素能影響反芻動物瘤胃內(nèi)能量代謝，改善瘤胃發(fā)酵功能，降低乙酸與丙酸的產(chǎn)出比例，從而減少甲烷排放，提高日糧利用率及生產(chǎn)性能，已廣泛應(yīng)用于反芻動物生產(chǎn)。Montoy的研究表明[11]，以青貯玉米為底物進(jìn)行體外發(fā)酵試驗時，添加0.0015mg/ml至0.003mg/ml的莫能菌素可以有效抑制甲烷排放量達(dá)30%～50%，但并未影響VFA濃度。本研究中莫能菌素組與對照組相比甲烷排放量降低了16.42%，減排量與報道差別較大，原因可能為發(fā)酵底物不同所致，但減排效果同樣顯著。VFV濃度與對照組相比未發(fā)生明顯變化。近年來，食品安全越來越受到消費者的重視，莫能菌素作為抗生素類添加劑，已被歐盟等發(fā)達(dá)國家禁止使用，尋找抗生素類替代品是畜牧業(yè)科研工作急需解決的問題。

3.3 綠茶提取物

植物提取物的有效成分主要為植物次生代謝產(chǎn)物。植物的次生代謝產(chǎn)物是植物自我保護(hù)的一種機制因為其具有抗菌活性所以用來防止草食動物攝食和病菌等的侵入，在進(jìn)入反芻動物瘤胃后通過改變其他細(xì)菌的活性來影響瘤胃內(nèi)甲烷菌從而影響反芻動物的瘤胃產(chǎn)甲烷量。Mao等研究表明[12]：綠茶提取物中含有大量的皂苷類物質(zhì)，當(dāng)在肉羊日糧中添加使用時甲烷產(chǎn)生量被顯著降低27%。在本研究中綠茶提取與對照組相比甲烷排放量和VFA濃度均未表現(xiàn)出顯著差異，原因可能是添加劑量及發(fā)酵底物不同，不能達(dá)到有效抑制瘤胃甲烷菌群活性的目的。

3.4 活性炭

研究表明[13]，在水稻生產(chǎn)中使用活性炭可降低甲烷的產(chǎn)生量，因為活性炭是具有多孔性的物質(zhì)，吸附能力較強，當(dāng)活性炭與飼草或青貯的混合會提供一種理想的系統(tǒng)，可以在反芻動物瘤胃內(nèi)通過吸附甲烷氣體，從而降低甲烷產(chǎn)生量，同時不影響瘤胃發(fā)酵功能。這個結(jié)果說明在以干草做底物時添加活性炭并不會使甲烷產(chǎn)量發(fā)生明顯改變，對VFA濃度也沒有影響。這與本研究的結(jié)果相一致。Sand S I[14]等研究發(fā)現(xiàn)，體外發(fā)酵試驗中當(dāng)活性炭與硝酸鹽類物質(zhì)混合后，降低甲烷產(chǎn)量效果優(yōu)于硝酸鹽類物質(zhì)單獨添加。其原因可能是因為活性炭可以促進(jìn)嗜甲烷菌的產(chǎn)生，其菌種特點是可以將甲烷作為唯一的碳源和能源，從而使瘤胃內(nèi)甲烷含量降低?；钚蕴颗c硝酸鹽混合使用，也許可為硝酸鹽類物質(zhì)在肉羊生產(chǎn)中的推廣使用提供新的途徑。

表1 不同添加劑對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

表2 不同添加劑對瘤胃液VFA濃度的影響

3.5 酵素

酵素是指植物進(jìn)行深層發(fā)酵，提取的一種含生物活性物質(zhì)的低鹽液體。其生物活性成分包括酶、發(fā)酵參與菌?？捎绊懶笄蒹w內(nèi)酶活性，從細(xì)胞層面調(diào)節(jié)機體的生命活動。酵素飼料添加劑一般是由多種益生菌株，運用生物發(fā)酵及復(fù)方配伍技術(shù)研制開發(fā)的一種綠色安全、無藥物應(yīng)激和藥物殘留的新型動物保健添加劑，在畜禽生產(chǎn)中具有抗應(yīng)激、促免疫、健腸胃、促消化的功效，通過增強畜禽機體性能，間接提高飼料利用率，目前多用于單胃動物生產(chǎn)，在反芻動物生產(chǎn)中應(yīng)用的研究報道較少。本研究中酵素對VFA濃度影響未達(dá)顯著水平，反而增加了甲烷排放量，可能是由于酵素內(nèi)多種酶的存在，促進(jìn)了瘤胃內(nèi)甲烷合成反應(yīng)的進(jìn)行，所導(dǎo)致的，其原因有待進(jìn)一步論證。

4 小結(jié)

肉羊瘤胃液體外發(fā)酵以羊草為底物的研究中：綠茶提取物、活性炭、酵素在甲烷產(chǎn)生量和VFA的濃度變化都未達(dá)顯著效果，故對瘤胃發(fā)酵能沒有影響。硝酸鹽不僅對甲烷產(chǎn)生量有顯著的抑制效果，同時未改變VFA濃度，且作用效果優(yōu)于莫能菌素，是肉羊生產(chǎn)中較為理想的潛在甲烷抑制劑。

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