張昕，徐連爽，王雪瑩，許宏源

(1.吉林工商學(xué)院 糧油食品深加工吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130507;2.吉林工商學(xué)院 糧食學(xué)院，長春 130507)

紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt是傳統(tǒng)的藥食同源植物，富含α-亞麻酸、花青素、甾醇、紫蘇酮、紫蘇醛和丁香油酚等特殊的營養(yǎng)和活性成分[1]。其果實(shí)紫蘇籽冷榨紫蘇油剩余的紫蘇粕中，含有高達(dá)40%左右的蛋白質(zhì)[2]，內(nèi)含18種氨基酸，含有人體所必需的8種氨基酸，其中賴氨酸、蛋氨酸的含量較高[3]。此外紫蘇粕中還含有粗纖維17.3%、粗脂肪8.7%和紫蘇特殊的活性成分，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[4]。目前，大量的紫蘇粕經(jīng)簡單加工添加到飼料中，紫蘇粕資源未得到充分利用[5]。我們研究利用紫蘇粕和豆粕共發(fā)酵生產(chǎn)紫蘇醬，有效利用紫蘇粕的營養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值，紫蘇粕特殊的營養(yǎng)成分、活性成分和風(fēng)味物質(zhì)保留在醬中，比傳統(tǒng)豆醬的調(diào)味、增香和保健功能更勝一籌。本研究探索發(fā)酵生產(chǎn)風(fēng)味紫蘇醬產(chǎn)品的制曲工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

L-酪氨酸 上海荔達(dá)生物科技有限公司；Folin-酚試劑 上海分子免疫生化實(shí)驗(yàn)室有限公司；干酪素、其他試劑(分析純) 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；紫蘇粕、豆粕、面粉(標(biāo)準(zhǔn)粉) 產(chǎn)地吉林省洮南市；食鹽 市售。

1.1.2 菌種

高大毛霉F3.06(Mucormucedo)：吉林工商學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室從自然發(fā)酵的紫蘇粕中分離的菌種。

1.1.3 培養(yǎng)基

制曲培養(yǎng)基：紫蘇粕35 g、豆粕65 g、面粉18 g、料水比10∶8。pH自然，121 ℃滅菌25 min[6，7]。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9023A臺(tái)式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司；LDZX-40BI立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)驗(yàn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPH-2102C溫度培養(yǎng)振蕩器 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；755B紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DFY-1000C實(shí)驗(yàn)室萬能粉碎機(jī) 上海豫明儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 成曲制備工藝流程

1.3.1.1 孢子懸液制備

采用培養(yǎng)120 h的高大毛霉斜面菌種。用含有0.1%吐溫80的無菌水10 mL洗脫孢子，移入三角瓶中，加入蝸牛酶和已滅菌的玻璃珠振蕩20 min左右，過濾除去菌絲和成團(tuán)的孢子。用血球計(jì)數(shù)板測定孢子濃度并用無菌生理鹽水稀釋孢子濃度約為1×106cfu/mL[8]。

1.3.1.2 制曲方法

紫蘇粕、豆粕粉碎為2.8 mm顆粒，料水比10∶8，添加40 ℃溫水浸潤8 h后，加入面粉混勻，121 ℃滅菌25 min，料溫自然降到32 ℃時(shí)，接種1×106cfu/mL高大毛霉F3.06孢子懸液，混合均勻后裝入曲盤培養(yǎng)，控制曲室溫度，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間定時(shí)翻曲1 min，曲料由白色轉(zhuǎn)為灰褐色時(shí)，制得成曲[9]。

1.3.2 中性蛋白酶活力測定方法

中性蛋白酶活力測定采用Folin-酚試劑比色法。

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取18支試管分成6組，每組3個(gè)平行樣，其中第1組的3支試管不加標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液做空白對(duì)照，其余5組試管中分別吸取100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL；6組試管中分別加入去離子水定容至1 mL，各加入0.4 mol/L的Na2CO3溶液5 mL和已稀釋的Folin-酚試劑1 mL，搖勻，置40 ℃水浴鍋中保溫發(fā)色20 min，用分光光度計(jì)在660 nm處測定吸光度值[10,11]。

1.3.2.2 成曲粗酶液的制備

稱取成曲1.00 g放入研缽中，逐漸加入pH 7.0的磷酸緩沖液50 mL研碎，置于40 ℃恒溫振蕩器中，以100 r/min浸提30 min，4層紗布過濾，濾液在4 ℃,4000 r/min離心15 min去除固形物，上清液用pH 7.0的磷酸緩沖液定容到100 mL即為粗酶液[12]。

1.3.2.3 成曲酶活力的測定

取4支試管，1號(hào)為空白，其余3支為樣品，分別加入成曲粗酶液1 mL，1號(hào)管立即加入0.4 mol/L的TCA溶液2 mL使酶失活，另3支樣品試管分別加入pH 7.0濃度為2%的酪蛋白緩沖液1 mL迅速混勻，放入40 ℃水浴保溫10 min后，立即加入0.4 mol/L的TCA溶液2 mL終止反應(yīng)，然后向1號(hào)管中加入1 mL的pH 7.0酪蛋白緩沖液，繼續(xù)保溫20 min，取出，在4 ℃，8000 r/min離心15 min去除固形物。分別移取上清液1 mL，加入0.4 mol/L的Na2CO3溶液5 mL和已稀釋的Folin-酚試劑1 mL，搖勻，置40 ℃水浴浸鍋中保溫發(fā)色20 min，用分光光度計(jì)在660 nm處測定吸光度值，以1號(hào)管做空白對(duì)照，樣品每次做3個(gè)平行，取平均值[13]。

1.3.2.4 酶活力定義

1 g成曲在40 ℃和pH值7.0條件下，1 min分解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為1個(gè)中性蛋白酶活力單位(U)。

1.3.2.5 計(jì)算公式

中性蛋白酶活力(U)=A×K×N×4/10。

式中：A為樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度值；K為吸光常數(shù)；N為稀釋倍數(shù)；4為反應(yīng)試劑的總體積；10為反應(yīng)時(shí)間10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 高大毛霉接種量對(duì)成曲中性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果

采用制曲培養(yǎng)基紫蘇粕35 g、豆粕65 g、面粉18 g、料水比10∶8。pH自然，121 ℃滅菌25 min。曲料溫度自然降到32 ℃時(shí),分別設(shè)定接菌量為2，3，4，5，6，7，8 mL/100 g接種高大毛霉1×106cfu/mL孢子懸液，在制曲溫度(28±1 )℃，制曲時(shí)間48 h，每12 h定時(shí)翻曲1 min條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)[14]，探究高大毛霉接種量對(duì)成曲中性蛋白酶活力的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 高大毛霉接種量對(duì)成曲中性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The experimental result for the impact of additive amount of Mucor mucedo on activity of neutral proteinase

由圖1可知，高大毛霉的接種量在2～5 mL/100 g時(shí)，隨著高大毛霉接種量的增加，成曲中性蛋白酶活力明顯提高，高大毛霉的接種量為5 mL/100 g時(shí)，中性蛋白酶活力達(dá)到 593.7 U/g，高大毛霉的接種量在5～8 mL/100 g時(shí)，隨著高大毛霉接種量的增加，成曲中性蛋白酶活力變化不明顯。因此，綜合考慮經(jīng)濟(jì)效益，選擇成曲蛋白酶活力較高的高大毛霉接種量5，6，7 mL/100 g進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 制曲溫度對(duì)成曲中性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果

采用制曲培養(yǎng)基和單因素優(yōu)化的接種量5 mL/100 g接種高大毛霉孢子懸液。分別設(shè)定制曲溫度為25，26，27，28，29，30，31 ℃[15]，制曲時(shí)間48 h，每12 h定時(shí)翻曲1 min條件下，探究制曲溫度對(duì)成曲中性蛋白酶活力的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 制曲溫度對(duì)成曲中性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The experimental result for the impact of koji-making temperature on activity of neutral proteinase

由圖2可知，制曲溫度在25～30 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，成曲中性蛋白酶活力明顯提高，制曲溫度在30～31 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，成曲中性蛋白酶活力明顯下降，因此，選擇成曲蛋白酶活力較高的3個(gè)制曲溫度28，29，30 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 制曲時(shí)間對(duì)成曲中性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果

在高大毛霉接種量5 mL/100 g，制曲溫度(30±1) ℃，每12 h定時(shí)翻曲1 min條件下，分別設(shè)定制曲時(shí)間為36，42，48，54，60，66，72 h時(shí)[16]，測定成曲的中性蛋白酶活力，探究制曲時(shí)間對(duì)成曲中性蛋白酶活力的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 制曲時(shí)間對(duì)成曲中性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The experimental result for the impact of koji-making time on activity of neutral proteinase

由圖3可知，中性蛋白酶活力隨制曲時(shí)間的變化規(guī)律，制曲時(shí)間在36～54 h時(shí)，隨著溫度的升高，成曲中性蛋白酶活力快速增加，制曲時(shí)間為54 h時(shí)，中性蛋白酶活力達(dá)到峰值659.1 U/g。制曲時(shí)間在54～72 h時(shí)，酶活力較高但緩慢下降，因此，選擇成曲中性蛋白酶活力較高3個(gè)制曲時(shí)間48，54，60 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4 翻曲間隔時(shí)間對(duì)成曲中性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果

在相鄰2次翻曲時(shí)間間隔分別為3，6，9，12，15，18，21 h條件下制曲[17]，高大毛霉接種量5 mL/100 g、制曲溫度(30±1) ℃條件下，制曲時(shí)間為54 h，測定成曲的中性蛋白酶活力，探究翻曲間隔時(shí)間對(duì)成曲中性蛋白酶活力的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 翻曲間隔時(shí)間對(duì)成曲中性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The experimental result for the impact of koji-stirring interval time on activity of neutral proteinase

由圖4可知，翻曲間隔時(shí)間在3～12 h時(shí)，成曲中性蛋白酶活力變化不明顯，呈緩慢下降趨勢，翻曲間隔時(shí)間在12～21 h時(shí)，成曲中性蛋白酶活力迅速下降。選擇成曲中性蛋白酶活力較高的3個(gè)翻曲間隔時(shí)間6，9，12 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.5 優(yōu)化制曲工藝條件的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

選擇接種量、制曲溫度、制曲時(shí)間、翻曲間隔時(shí)間四因素的三水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，測定成曲的中性蛋白酶活力，優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)風(fēng)味紫蘇醬的制曲工藝條件，結(jié)果見表1。

表1 優(yōu)化制曲工藝條件的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 L9(34) orthogonal test results for optimization of koji-making conditions

續(xù) 表

由表1可知，各因素對(duì)成曲中性蛋白酶活力的影響大小順序依次為C>B>A>D，即制曲時(shí)間>制曲溫度>接種量>翻曲間隔時(shí)間。最佳方案為A2B2C2D1，即1×106cfu/mL高大毛霉孢子懸液接種量6 mL/100 g，制曲溫度29 ℃，制曲時(shí)間54 h，2次翻曲間隔時(shí)間6 h。

2.6 試驗(yàn)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證L9(34)正交試驗(yàn)方法優(yōu)化紫蘇粕和豆粕發(fā)酵生產(chǎn)紫蘇醬的制曲工藝的可行性，運(yùn)用2.5正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的制曲工藝參數(shù)，以中性蛋白酶活力為考察指標(biāo)，試驗(yàn)做3個(gè)平行。測得的中性蛋白酶活力為698.3 U/g，比優(yōu)化前提高了17.62%，這說明采用L9(34)正交試驗(yàn)方法優(yōu)化紫蘇粕和豆粕發(fā)酵生產(chǎn)紫蘇醬的制曲工藝條件合理可行。

3 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)和L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行紫蘇粕和豆粕發(fā)酵生產(chǎn)紫蘇醬的制曲工藝條件優(yōu)化，得到最優(yōu)的工藝條件：1×106cfu/mL高大毛霉孢子懸液的接菌量6 mL/100 g，制曲溫度29 ℃，制曲時(shí)間54 h，翻曲間隔時(shí)間6 h。按照最優(yōu)工藝條件進(jìn)行紫蘇粕和豆粕發(fā)酵生產(chǎn)紫蘇醬的制曲，得到中性蛋白酶活力最高為698.3 U/g，比優(yōu)化前提高了17.62%。

本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，與響應(yīng)面優(yōu)化方法相比具有一定的局限性[18]。下一步擬采用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)制曲工藝進(jìn)行優(yōu)化，以便于得到更高的中性蛋白酶活力，為工業(yè)化生產(chǎn)提供工藝參數(shù)。

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