馬曉潔，陳巧云，余曦冉

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 腫瘤科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院2013級臨床醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637000）

微流控芯片是一種新型的技術(shù)平臺，它利用不同的芯片材料構(gòu)造出微米級的通道結(jié)構(gòu)，結(jié)合微流體控制技術(shù)，能夠相對精確地再現(xiàn)腫瘤微環(huán)境，并能動態(tài)地觀察血管生成過程中腫瘤微環(huán)境所發(fā)生的變化。以其獨特的優(yōu)勢，有逐漸取代傳統(tǒng)的腫瘤血管生成體外模型的趨勢。本文就微流控在腫瘤血管生成中的應(yīng)用做一綜述。

1 微流控技術(shù)

微流控技術(shù)是研究如何在微米和亞微米尺度下控制微小流體和顆粒的科學(xué)，以分子分析、生化防御、分子生物學(xué)和微機電系統(tǒng)技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的1個新興學(xué)科，已在醫(yī)學(xué)方面得到廣泛的研究和應(yīng)用。微流控芯片（microflu-idics）是微流控技術(shù)的具體實現(xiàn)形式，是目前微全分析系統(tǒng)（micro total analysis system，u-TAS）中發(fā)展最為迅速和熱門的領(lǐng)域。

不同的微流控芯片可以發(fā)揮不同的作用，集成聚碳酸酯多孔膜的雙層通道微芯片裝置可以模擬細胞的相互作用，而具有多層微通道結(jié)構(gòu)的微流控芯片，能篩選出最利于細胞生長的芯片通道條件[1]。微流控技術(shù)具有非接觸、精確度高、組織培養(yǎng)、營養(yǎng)供應(yīng)和廢物清除功能等[2]優(yōu)點，而且其與傳統(tǒng)的流體系統(tǒng)相比，具有許多優(yōu)勢尤其是其強大的集成能力，可使實驗中的反應(yīng)、前處理及檢測等流程都能集成到1個微流控系統(tǒng)中完成。所以該項技術(shù)已在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等眾多科學(xué)領(lǐng)域展示前所未有的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用價值。

2 腫瘤血管生成模型

腫瘤血管生成是指已存在的毛細血管網(wǎng)通過“萌芽”或“分叉”等方式生長出新的毛細血管的過程，其具體形成方式包括了出芽式血管生成[3]、血管生成擬態(tài)[4]、馬賽克血管[5]、血管共選擇[6]、募集內(nèi)皮祖細胞[7]和淋巴管生成等[8]。

目前傳統(tǒng)的腫瘤血管生成體外模型包括：①內(nèi)皮細胞增殖實驗?zāi)Ｐ停菏窃谀[瘤血管生成中內(nèi)皮細胞大多呈過表達狀態(tài)為依據(jù)。檢測細胞增殖常用方法：MTT法、SRB法、[3H]胸腺嘧啶核苷摻入法[9]。其缺點分別為：MTT法的實驗結(jié)果受到細胞數(shù)量、MTT濃度、殘留培養(yǎng)液的影響；SRB法只適用于貼壁細胞，而且操作過程繁瑣，易造成人為誤差；[3H]胸腺嘧啶核苷摻入法不僅要使用具有安全風(fēng)險的放射性物質(zhì)，而且需要通過細胞凋亡實驗藥物來評估藥物對細胞增殖的影響，以排除藥物毒性作用因素；②細胞遷移實驗?zāi)Ｐ停喊▌?chuàng)傷愈合模型和Boyden小室模型。這2種模型存在的缺點：創(chuàng)傷愈合模型，操作簡便，但忽視劃傷單層細胞后傷痕愈合過程中細胞增殖對實驗結(jié)果的影響[10]。Boyden小室模型，操作技術(shù)要求高且人為因素影響較大，而計數(shù)方法不同也會造成統(tǒng)計結(jié)果誤差較大[9]；③管腔形成模型：主要是考察內(nèi)皮細胞在基質(zhì)表面形成毛細血管網(wǎng)的能力[11]，該法不能實現(xiàn)對血管形成過程的實時動態(tài)的監(jiān)測；④大鼠動脈環(huán)模型：是將包埋于纖維蛋白膠或膠原蛋白膠的大鼠動脈環(huán)在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察血管出芽情況的方法[12]。但其缺乏正常的血液循環(huán)系統(tǒng)，使所處的血管環(huán)境脫離腫瘤微環(huán)境而導(dǎo)致其新生的血管的特性上與腫瘤微血管有差異。

腫瘤血管形成是1個非常復(fù)雜的過程，受多種因子的影響[13]。目前，傳統(tǒng)的實驗方法除其自身的缺點外，大多只是通過單因素、二維、甚至靜態(tài)的方式進行研究，未能實現(xiàn)在3D條件下對血管生成過程進行動態(tài)的、多因子間的研究。而且傳統(tǒng)的體外腫瘤血管生成模型僅僅針對腫瘤和血管的培養(yǎng)，而忽視對腫瘤微環(huán)境對血管生成的影響，缺乏腫瘤微環(huán)境的內(nèi)皮細胞容易出現(xiàn)分子特征的變化，使得最終獲得的實驗結(jié)果與實際存在巨大的差距。為克服上述缺點，構(gòu)建出更接近理想的腫瘤血管生成模型的體外模型成為一項艱巨的任務(wù)。

3 微流控在腫瘤血管生成中的應(yīng)用

近年來，微流控芯片技術(shù)發(fā)展迅速，在生命科學(xué)尤其是細胞研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。微流控技術(shù)不光可以模擬腫瘤細胞生長微環(huán)境，為腫瘤微環(huán)境下的相關(guān)問題研究提供1個簡便的研究平臺，還可以給細胞提供一個立體的生長環(huán)境，實現(xiàn)對腫瘤微環(huán)境中細胞轉(zhuǎn)移的各種關(guān)鍵參數(shù)進行動態(tài)調(diào)節(jié)[14]，實時動態(tài)觀察細胞如何適應(yīng)腫瘤微環(huán)境的變化[15]，并可以實現(xiàn)在可溶性生化因子的濃度梯度分布下腫瘤血管細胞生長的研究[16]。

3.1 微流控技術(shù)可以輕松解決對培養(yǎng)環(huán)境中流體壓力的精確控制的難題

在腫瘤微環(huán)境內(nèi)高滲性腫瘤血管提高間質(zhì)流體壓力并改變流動模式，該異常流體壓力可以通過刺激腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞進而促進腫瘤血管生成推動腫瘤生長進程。BUCHANAN等[17]設(shè)計的一種體外腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的微流控系統(tǒng)，以探究不同流動剪切應(yīng)力對腫瘤血管生成的影響，通過定量轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的分析下游分子，發(fā)現(xiàn)在管腔低流量條件下與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的腫瘤細胞增加促血管生成基因的表達。這凸顯出微流控技術(shù)在評估內(nèi)皮和腫瘤細胞對不同流動剪切應(yīng)力條件下腫瘤血管生成反應(yīng)的優(yōu)勢。

3.2 微流控技術(shù)可以再現(xiàn)腫瘤微環(huán)境

由腫瘤細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、免疫細胞和細胞外基質(zhì)及其分泌的生長因子參與組成的腫瘤生長局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境，稱為腫瘤微環(huán)境。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管的生成與微環(huán)境中各因素的變化著密切的關(guān)系[18]。微流控技術(shù)可模擬腫瘤微環(huán)境，研究其對腫瘤血管生成的影響。STROOCK等[19]構(gòu)建一微流控平臺，能夠很好地實現(xiàn)對腫瘤微環(huán)境的再現(xiàn)，包括大部分由腫瘤細胞組成的混合細胞群及其周圍的間質(zhì)細胞和由內(nèi)皮細胞內(nèi)襯的血管，并通過仿生灌注免疫細胞來模擬其被運輸和招募的過程。這實現(xiàn)對腫瘤微環(huán)境的近似模擬，使得構(gòu)建出的模型更接近體內(nèi)腫瘤微環(huán)境。

傳統(tǒng)體外模型往往因其無法控制生化梯度和獲取單細胞水平的圖像而停滯不前。微流控技術(shù)下的體外模型可很好彌補這點缺憾。CHUNG等[20]制作一種新型微流控平臺，在這個平臺上通過訪問圖像來實現(xiàn)對生化和生物力學(xué)因素的采集，可以清楚地觀察到Mtln3癌細胞系吸引的內(nèi)皮細胞和誘導(dǎo)血管生成的過程，與此同時還能實現(xiàn)對內(nèi)皮細胞與癌細胞共培養(yǎng)環(huán)境中的機械、生化因素的精確控制，來完成對腫瘤血管生成的影響因素進一步探討。LEE等[21]提出有關(guān)于轉(zhuǎn)移腫瘤產(chǎn)生微血管的微流控芯片，與其他模型相比其優(yōu)點在于腫瘤血管生成過程中癌組織與血管接口可實現(xiàn)精確成像，并對血管生成反應(yīng)和腫瘤細胞的跨內(nèi)皮遷移的定量分析。

3.3 微流控技術(shù)能實現(xiàn)對腫瘤血管的特性的模擬還原

腫瘤血管不同于正常組織血管，其特性表現(xiàn)為：①血管結(jié)構(gòu)扭曲多變，管徑大小不一；②血管壁薄而具有高度通透性；③血管血流紊亂，常靜止不流動或倒流[22]。該腫瘤血管的特性在傳統(tǒng)的體外血管生成模型常未被考慮，而微流控卻能憑借自身優(yōu)勢實現(xiàn)對腫瘤血管的特性進行模擬還原。對此翟萬銀等[23]運用微加工技術(shù)，構(gòu)建腫瘤血管微流控芯片。該芯片不僅能夠控制微管道內(nèi)液體的流動方向和速度，實現(xiàn)腫瘤血管內(nèi)血液流向、流速的多變特點的模擬，并能節(jié)段性地調(diào)整微縫段管道的流向和流速模擬扭曲和粗細變化不均的腫瘤血管結(jié)構(gòu)，還能通過促進內(nèi)皮細胞遷移而使得血管出現(xiàn)穩(wěn)定的泄漏點，實現(xiàn)對腫瘤血管高通透性的特點進行再現(xiàn)，這使得構(gòu)建出的腫瘤血管更接近真實情況。

3.4 微流控技術(shù)可重建體內(nèi)血管出芽形成過程

出芽式血管生成是腫瘤血管生成的主要方式。傳統(tǒng)體外模型不能模擬出從內(nèi)皮細胞到尖端細胞及柄細胞演變的動態(tài)過程，而微流控技術(shù)在細胞的定性、定量研究和增強成像以及內(nèi)部生物控制能力上的優(yōu)勢，能夠再現(xiàn)該過程。

NGUYEN等[24]構(gòu)建一種三維出芽式血管生成的微流控模型，實時動態(tài)地觀察到與體內(nèi)出芽式血管生成標(biāo)志結(jié)構(gòu)一致的特征，由此表明該三維微流控模型能夠很好重建體內(nèi)血管出芽形成過程，有助于人們對該過程中所受影響因素展開研究。VERBRIDGE等[25]制作一種微流控模型，通過該仿生模型可觀察在血管內(nèi)皮生長因子的空間梯度變化下內(nèi)皮細胞涂層血管的出芽情況，并能夠?qū)崿F(xiàn)微流控平臺上生物和物理參數(shù)的調(diào)節(jié)。JEONG等[26]構(gòu)建一微流控平臺，通過其不僅能夠精確控制內(nèi)皮細胞的化學(xué)刺激，而且具備優(yōu)良的光學(xué)分辨率和原位監(jiān)測在化學(xué)梯度變化下的細胞形態(tài)的改變，這使得出芽式血管生成的整個動態(tài)演變過程能得到真實的反應(yīng)。

3.5 微流控在腫瘤血管生成應(yīng)用中存在的缺陷

微流控技術(shù)成功地用用宏觀尺度的方法來真實地模擬血管的生成、入侵及外滲，并取得可喜的成果。但即使是目前最先進的三維微血管灌注式模型仍然不不具備趨化因子梯度定向誘導(dǎo)癌細胞趨化遷移的能力，且新生血管網(wǎng)的幾何結(jié)構(gòu)也難以預(yù)測[27]。有研究者試圖克服該問題，HYUNJAE等[28]人建立1個模型，能實現(xiàn)清楚地成像和定量血管生成反應(yīng)，具備介導(dǎo)癌細胞進入與微血管壁相鄰的不同位置的能力，即腫瘤細胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移，同時模型能產(chǎn)生和維持生長因子和引誘劑的空間濃度梯度。然而，該模型仍然有缺陷，即血管出芽起源于沒有細胞-細胞連接的內(nèi)皮細胞簇，而不是先前存在的血管，這與體內(nèi)病理狀態(tài)下，腫瘤血管生成出芽起源于癌群附近完全血管有所差異。

所以綜合起來微流控腫瘤-血管生成模型仍然存在一系列亟待解決的問題：①從微流控獲得的結(jié)果與臨床腫瘤組織間情況的關(guān)聯(lián)性問題[29]；②對體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的還原度問題；③模型的穩(wěn)定性和可重復(fù)性問題。針對該缺點，都需要進一步深入探索研究來使模型更加完善。

4 結(jié)論與展望

現(xiàn)今腫瘤血管生成體外模型的不斷地被人們應(yīng)用于腫瘤血管的研究，隨著人們對腫瘤血管的認識逐漸深入，多種的血管生成方式為人們所熟知。這也為腫瘤血管體外模型的構(gòu)建提供更多的方向，而微流控技術(shù)憑借其各項優(yōu)勢為腫瘤血管生成體外模型的研究提供很好的研究前景，雖然目前還有一些需要大家繼續(xù)探索解決的問題，但是整體上該技術(shù)的先進性有效性是毋庸置疑的，期待該技術(shù)在不久的將來大放異彩。

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