周爽,尤昕
(延邊大學附屬醫(yī)院檢驗科,吉林 延吉 133000)
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease,CAD)(簡稱冠心?。┦?種全球范圍內常見的慢性病,已經(jīng)成為導致人類死亡的最主要病因之一。冠心病的發(fā)病機制復雜,目前普遍認為受環(huán)境和遺傳兩大因素的共同影響,隨著分子遺傳生物學的迅速發(fā)展,對其遺傳因素方面的研究也越來越受到重視[1]。自人類基因組計劃實施以來,人們對冠心病有更加深入了解,文獻表明,遺傳因素在冠心病發(fā)病過程中的貢獻高達50%[2]。近年來,全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association studies,GWAS)被廣泛應用于復雜多基因疾病的研究之中,以單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)為基礎的全基因組關聯(lián)分析已成為研究冠心病遺傳易感性的主流方法,通過該方法研究發(fā)現(xiàn)的冠心病相關基因位點已達50多個[3]。GUCY1A3基因位于4號染色體q32.1,長77353 bp,含有13個外顯子,編碼690個氨基酸,這些氨基酸組成可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)的(α1亞基。GUCY1A3基因已被認為在CAD的高遺傳風險中發(fā)揮著重要作用[4]??扇苄曾B苷酸環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclase,sGC)作為1種信號轉導酶廣泛分布于人體中,并介導心血管系統(tǒng)的許多生理過程,例如促進血管平滑肌舒張,抑制血小板聚集和血管重構等,因此sGC成為維持心血管穩(wěn)態(tài)的關鍵酶[5]。該試驗選取GUCY1A3基因位點rs7692387進行研究,分析其單核苷酸多態(tài)性與延邊地區(qū)漢族人群CAD遺傳易感性之間的關系,為開展針對性的人群預防提供新線索,同時也為延緩或防止CAD的發(fā)生提供更多的理論依據(jù)。
選取延邊大學附屬醫(yī)院心血管內科住院且相互之間無血緣關系的漢族冠心病患者204例,均符合世界衛(wèi)生組織制定的缺血性心臟病的診斷標準,且經(jīng)冠狀動脈造影檢查證實至少1支冠脈狹窄≥50%。對照組201例選自延邊大學附屬醫(yī)院健康體檢科體檢結果正常,且通過詢問病史、輔助檢查等明確排除心血管疾病的健康人。通過查閱病案資料、問卷訪談等形式收集研究對象的基本資料及既往病史等,所有研究對象均簽署知情同意書。
DNA提取試劑盒(美國Promega公司),SNaPshot試劑盒:ABI PRISM SNa Pshot Multiplex Kit(美國ABI公司),Taq酶:KAPA Taq Hot Start DNA Polymerase(Kapabiosystems公司),SAP 酶(Fermentas公司)、ExoI酶和CIP酶(NEB公司),瓊脂糖(美國Invitrogen公司)。
Beckman Allgre 21R高速冷凍離心機(Beckman公司),BC-subMIDI電泳儀(北京六一儀器廠),JY300 C電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司),Bio Sens SC 810B凝膠成像儀(上海山富科學儀器有限公司),PTC-100PCR儀(MJ公司),ABI 9700擴增儀(ABI公司),3730XL測序儀(美國ABI公司)。
研究對象的GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型及等位基因的檢測過程主要包括設計合成引物、提取DNA、預擴增、預擴增產物純化、延伸反應、延伸產物純化、上機檢測及整理分析數(shù)據(jù)。根據(jù)Genbank獲得的GUCY1A3基因所在序列的信息,應用Primer 5.0軟件設計rs7692387位點的特異性引物。正向引物:5'-CACTTCACTGTGGAAAC(C/T)GAG-3',反向引物:5'-GTGCCTACAATGATGCCTGG-3'。入選的研究對象均在清晨空腹狀態(tài)下采集外周靜脈血2 ml于抗凝管中,室溫搖勻后置-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?,采用DNA提取試劑盒按使用說明書提取并純化DNA。以聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增含有目的位點的基因片段。PCR反應體系包含提取 DNA(10~20 ng/μl)2 μl,2.5×BufferⅣ 4.0 μl,Taq(5 u/L)0.15 μl,引物(5 μmol,F(xiàn)+R)1.5 μl,加去離子水至10 μl。PCR擴增條件為95℃預變性5 min,95℃變性 30 s,60℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,共35個循環(huán),72℃終末延伸10 min。PCR產物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳質檢。將所得產物用ExoI酶消化后純化再加入延伸體系,延伸體系包括消化后預擴增產物1.2 μl,Primers Mix 2 μl,ABI Mix 0.5 μl,10×Buffer I 0.4 μl,加去離子水至5 μl。將所得延伸產物純化后加入3730XL測序儀,采用美國ABI公司開發(fā)的Sna Pshot技術進行檢測,該技術是基于熒光標記單堿基延伸原理的1種分型技術。最后應用分析軟件將檢測所得的原始數(shù)據(jù)文件進行整理分析。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用t檢驗,計數(shù)資料采用χ2檢驗。兩組研究對象的基因型分布采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗其是否具有群體代表性。等位基因頻率及基因型頻率分布差異情況采用χ2檢驗進行分析。應用Logistic回歸分析校正混雜因素對冠心病的影響,并計算值和95%可信區(qū)間(95%CI),以檢測GUCY1A3基因位點rs7692387單核苷酸多態(tài)性和冠心病的相關性,以雙側P <0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
冠心病組和對照組在性別、年齡、BMI、收縮壓、舒張壓、糖尿病史、TC及TG方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P <0.05),研究對象平均年齡符合冠心病的高發(fā)年齡。冠心病組高血壓、吸煙史及LDL-C均高于對照組,HDL-C低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見表 1。
表1 兩組的臨床資料比較
研究對象的GUCY1A3基因位點rs7692387共有3種基因型(見圖1):純合子GG、AA,雜合子GA,純合子基因型顯示的峰型是單峰,雜合子基因型顯示的峰型是套峰。延伸體系中包含4種熒光標記的ddNTP,分別用藍色、黑色、綠色、紅色代表延伸加入ddGTP、ddCTP、ddATP及ddTTP的延伸產物,根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類,從而確定該樣本的基因型。
兩組分別進行Hardy-Weinberg平衡檢驗,兩組研究對象GUCY1A3基因位點rs7692387基因型頻率的觀察值與理論預測值比較差異無統(tǒng)計學意義(P <0.05),表明該研究的人群符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。GUCY1A3基因位點rs7692387 G/A多態(tài)性檢測結果顯示,冠心病組GG基因型頻率高于對照組,而對照組GA+AA基因型頻率高于冠心病組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05),G和A 2等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見表2。
將研究對象作為整體進行分析,以GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型(GG=1,GA+AA=2)、年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓、舒張壓作為自變量,有無冠心?。ㄓ?1,無=0)作為因變量建立Logistic回歸模型。結果顯示,排除可能與冠心病有關的一些混雜因素后,GUCY1A3基因位點rs7692387的GG基因型與GA+AA基因型比較,其可增加冠心病的患病風險2.327,P=0.039),表明GG基因型可能是冠心病發(fā)病的易感基因型。見表3。
圖1 GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型測序結果
表2 GUCY1A3基因位點rs7692387基因型頻率及等位基因頻率分布比較
表3 GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型與冠心病的Logistic回歸分析
將研究對象作為整體進行分析,以GUCY1A3基因位點rs7692387 的等位基因(A=1,G=2)、年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓、舒張壓作為自變量,有無冠心病(有=1,無=0)作為因變量建立Logistic回歸模型。結果顯示,排除可能與冠心病有關的一些混雜因素后,GUCY1A3基因位點rs7692387的A等位基因與G等位基因比較,其可降低冠心病的患病風險表明A等位基因可能是冠心病的保護性基因。見表4。
表4 GUCY1A3基因位點rs7692387的等位基因與冠心病的Logistic回歸分析
冠心病是嚴重影響人類健康和生活質量的心血管疾病之一,其發(fā)病率和死亡率逐年上升,如今已成為我國城鄉(xiāng)居民疾病死亡的首要原因[6]。冠心病是1種多基因疾病,遺傳因素對其發(fā)生和發(fā)展有影響,該基因的多態(tài)性和冠心病之間的關系是目前研究的主要方向?;蚨鄳B(tài)性反映基因的選擇性表達,是人類基因組在抵御不良環(huán)境影響過程中的1種適應性表現(xiàn),包括SNP、DNA重復序列多態(tài)性以及DNA片段長度多態(tài)性,在疾病易感性和人體對疾病的抵抗力等方面發(fā)揮重要作用[7]。SNP是基因多態(tài)性中最常見的1種,已被列為對復雜性疾病產生影響的最主要因素之一[8]。已有研究證實,單個或多個基因的遺傳易感性會對CAD的發(fā)病產生直接影響,且不同地域、種族或同種族不同地域人口的CAD易感性具有差異[9]。全基因組關聯(lián)分析檢測到GUCY1A3基因座常見的非編碼區(qū)突變與CAD之間具有很強的關聯(lián)性[10]。GUCY1A3基因是編碼sGC的α1亞基,sGC是NO-sGC-cGMP信號轉導通路中的關鍵酶,大部分以α1/β1異二聚體的形式廣泛分布于許多實質臟器及各種組織細胞中[11]。當體內的sGC被NO激活,激活的sGC可以將GTP轉化為cGMP,后者則作為細胞內調節(jié)信息的傳遞者,介導舒張血管、降低血壓及促進Na+排泄等正常生理活動[12]。動物實驗研究也證明,若將大鼠的sGCα1、α2或sGCβ1基因敲除,其血管平滑肌舒張、血壓調節(jié)及血小板聚集等方面的功能均會較正常對照組產生不同程度的紊亂,部分會發(fā)生嚴重疾病,甚至死亡[13]。與之類似,心血管系統(tǒng)疾病患者體內的NO-sGC-cGMP信號通路也常為紊亂狀態(tài),其根本原因是NO在病理狀態(tài)下被清除,導致通路中最重要的第二信使cGMP無法被正常激活,從而不能發(fā)揮其正常生理功能[14]。綜上,NO-sGC-cGMP通路在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中顯得尤為重要,其將成為多種心血管系統(tǒng)疾?。ㄈ绻谛牟?、心肌梗死、心力衰竭和慢性肺心病等)有效治療靶標[15]。
本研究結果顯示,入選的研究對象基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,表明所收集的樣本基本能代表延邊地區(qū)漢族人群GUCY1A3基因多態(tài)性分布。本研究中冠心病組GG基因型頻率高于對照組,而對照組GA+AA基因型頻率高于冠心病組,有差異。應用Logistic回歸分析排除年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓、舒張壓該混雜因素的作用后,有差異,與基因型為GA+AA者比較,基因型為GG者其患CAD的危險性增加,表明GG基因型很可能是延邊地區(qū)漢族人群冠心病發(fā)病的易感基因型。GUCY1A3基因位點rs7692387的A等位基因頻率分布在對照組中高于CAD組,而G等位基因頻率分布在CAD組中高于對照組,有差異。應用Logistic回歸分析排除年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓及舒張壓該混雜因素的影響后,有差異,與攜帶G等位基因比較,攜帶A等位基因可降低冠心病的患病風險,表明A等位基因可能是延邊地區(qū)漢族人群冠心病的保護性基因。
本研究在一定程度上為冠心病易感人群的篩選及保護提供理論依據(jù),從而根據(jù)不同個體的基因多態(tài)性實施針對性的早期干預,對冠心病的預防及個性化治療具有重要意義。同時由于國內外對GUCY1A3基因位點rs7692387的研究較少,該試驗的結果仍需在擴大樣本含量的基礎上,對不同種族、不同地域的人群進行更加深入的研究。
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