周爽，尤昕

（延邊大學附屬醫(yī)院檢驗科，吉林 延吉 133000）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease，CAD）（簡稱冠心?。┦?種全球范圍內常見的慢性病，已經(jīng)成為導致人類死亡的最主要病因之一。冠心病的發(fā)病機制復雜，目前普遍認為受環(huán)境和遺傳兩大因素的共同影響，隨著分子遺傳生物學的迅速發(fā)展，對其遺傳因素方面的研究也越來越受到重視[1]。自人類基因組計劃實施以來，人們對冠心病有更加深入了解，文獻表明，遺傳因素在冠心病發(fā)病過程中的貢獻高達50%[2]。近年來，全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association studies，GWAS）被廣泛應用于復雜多基因疾病的研究之中，以單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）為基礎的全基因組關聯(lián)分析已成為研究冠心病遺傳易感性的主流方法，通過該方法研究發(fā)現(xiàn)的冠心病相關基因位點已達50多個[3]。GUCY1A3基因位于4號染色體q32.1，長77353 bp，含有13個外顯子，編碼690個氨基酸，這些氨基酸組成可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）的(α1亞基。GUCY1A3基因已被認為在CAD的高遺傳風險中發(fā)揮著重要作用[4]?？扇苄曾B苷酸環(huán)化酶（soluble guanylyl cyclase，sGC）作為1種信號轉導酶廣泛分布于人體中，并介導心血管系統(tǒng)的許多生理過程，例如促進血管平滑肌舒張，抑制血小板聚集和血管重構等，因此sGC成為維持心血管穩(wěn)態(tài)的關鍵酶[5]。該試驗選取GUCY1A3基因位點rs7692387進行研究，分析其單核苷酸多態(tài)性與延邊地區(qū)漢族人群CAD遺傳易感性之間的關系，為開展針對性的人群預防提供新線索，同時也為延緩或防止CAD的發(fā)生提供更多的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取延邊大學附屬醫(yī)院心血管內科住院且相互之間無血緣關系的漢族冠心病患者204例，均符合世界衛(wèi)生組織制定的缺血性心臟病的診斷標準，且經(jīng)冠狀動脈造影檢查證實至少1支冠脈狹窄≥50%。對照組201例選自延邊大學附屬醫(yī)院健康體檢科體檢結果正常，且通過詢問病史、輔助檢查等明確排除心血管疾病的健康人。通過查閱病案資料、問卷訪談等形式收集研究對象的基本資料及既往病史等，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑

DNA提取試劑盒（美國Promega公司），SNaPshot試劑盒：ABI PRISM SNa Pshot Multiplex Kit（美國ABI公司），Taq酶：KAPA Taq Hot Start DNA Polymerase（Kapabiosystems公司），SAP 酶（Fermentas公司）、ExoI酶和CIP酶（NEB公司），瓊脂糖（美國Invitrogen公司）。

1.3 儀器與設備

Beckman Allgre 21R高速冷凍離心機（Beckman公司），BC-subMIDI電泳儀（北京六一儀器廠），JY300 C電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司），Bio Sens SC 810B凝膠成像儀（上海山富科學儀器有限公司），PTC-100PCR儀（MJ公司），ABI 9700擴增儀（ABI公司），3730XL測序儀（美國ABI公司）。

1.4 試驗方法

研究對象的GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型及等位基因的檢測過程主要包括設計合成引物、提取DNA、預擴增、預擴增產物純化、延伸反應、延伸產物純化、上機檢測及整理分析數(shù)據(jù)。根據(jù)Genbank獲得的GUCY1A3基因所在序列的信息，應用Primer 5.0軟件設計rs7692387位點的特異性引物。正向引物：5'-CACTTCACTGTGGAAAC（C/T）GAG-3'，反向引物：5'-GTGCCTACAATGATGCCTGG-3'。入選的研究對象均在清晨空腹狀態(tài)下采集外周靜脈血2 ml于抗凝管中，室溫搖勻后置-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?，采用DNA提取試劑盒按使用說明書提取并純化DNA。以聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增含有目的位點的基因片段。PCR反應體系包含提取 DNA（10～20 ng/μl）2 μl，2.5×BufferⅣ 4.0 μl，Taq（5 u/L）0.15 μl，引物（5 μmol，F(xiàn)+R）1.5 μl，加去離子水至10 μl。PCR擴增條件為95℃預變性5 min，95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共35個循環(huán)，72℃終末延伸10 min。PCR產物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳質檢。將所得產物用ExoI酶消化后純化再加入延伸體系，延伸體系包括消化后預擴增產物1.2 μl，Primers Mix 2 μl，ABI Mix 0.5 μl，10×Buffer I 0.4 μl，加去離子水至5 μl。將所得延伸產物純化后加入3730XL測序儀，采用美國ABI公司開發(fā)的Sna Pshot技術進行檢測，該技術是基于熒光標記單堿基延伸原理的1種分型技術。最后應用分析軟件將檢測所得的原始數(shù)據(jù)文件進行整理分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。兩組研究對象的基因型分布采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗其是否具有群體代表性。等位基因頻率及基因型頻率分布差異情況采用χ2檢驗進行分析。應用Logistic回歸分析校正混雜因素對冠心病的影響，并計算值和95%可信區(qū)間（95%CI），以檢測GUCY1A3基因位點rs7692387單核苷酸多態(tài)性和冠心病的相關性，以雙側P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的一般臨床資料比較

冠心病組和對照組在性別、年齡、BMI、收縮壓、舒張壓、糖尿病史、TC及TG方面比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），研究對象平均年齡符合冠心病的高發(fā)年齡。冠心病組高血壓、吸煙史及LDL-C均高于對照組，HDL-C低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表 1。

表1 兩組的臨床資料比較

2.2 基因測序結果

研究對象的GUCY1A3基因位點rs7692387共有3種基因型（見圖1）：純合子GG、AA，雜合子GA，純合子基因型顯示的峰型是單峰，雜合子基因型顯示的峰型是套峰。延伸體系中包含4種熒光標記的ddNTP，分別用藍色、黑色、綠色、紅色代表延伸加入ddGTP、ddCTP、ddATP及ddTTP的延伸產物，根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。

2.3 兩組GUCY1A3基因位點rs7692387單核苷酸多態(tài)性與冠心病的關系

兩組分別進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，兩組研究對象GUCY1A3基因位點rs7692387基因型頻率的觀察值與理論預測值比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），表明該研究的人群符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。GUCY1A3基因位點rs7692387 G/A多態(tài)性檢測結果顯示，冠心病組GG基因型頻率高于對照組，而對照組GA+AA基因型頻率高于冠心病組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），G和A 2等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表2。

2.4 GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型與冠心病患病風險評估

將研究對象作為整體進行分析，以GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型（GG=1，GA+AA=2）、年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓、舒張壓作為自變量，有無冠心?。ㄓ?1，無=0）作為因變量建立Logistic回歸模型。結果顯示，排除可能與冠心病有關的一些混雜因素后，GUCY1A3基因位點rs7692387的GG基因型與GA+AA基因型比較，其可增加冠心病的患病風險2.327，P=0.039），表明GG基因型可能是冠心病發(fā)病的易感基因型。見表3。

圖1 GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型測序結果

表2 GUCY1A3基因位點rs7692387基因型頻率及等位基因頻率分布比較

表3 GUCY1A3基因位點rs7692387的基因型與冠心病的Logistic回歸分析

2.5 GUCY1A3基因位點rs7692387的等位基因與冠心病患病風險評估

將研究對象作為整體進行分析，以GUCY1A3基因位點rs7692387 的等位基因（A=1，G=2）、年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓、舒張壓作為自變量，有無冠心病（有=1，無=0）作為因變量建立Logistic回歸模型。結果顯示，排除可能與冠心病有關的一些混雜因素后，GUCY1A3基因位點rs7692387的A等位基因與G等位基因比較，其可降低冠心病的患病風險表明A等位基因可能是冠心病的保護性基因。見表4。

表4 GUCY1A3基因位點rs7692387的等位基因與冠心病的Logistic回歸分析

3 討論

冠心病是嚴重影響人類健康和生活質量的心血管疾病之一，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，如今已成為我國城鄉(xiāng)居民疾病死亡的首要原因[6]。冠心病是1種多基因疾病，遺傳因素對其發(fā)生和發(fā)展有影響，該基因的多態(tài)性和冠心病之間的關系是目前研究的主要方向?；蚨鄳B(tài)性反映基因的選擇性表達，是人類基因組在抵御不良環(huán)境影響過程中的1種適應性表現(xiàn)，包括SNP、DNA重復序列多態(tài)性以及DNA片段長度多態(tài)性，在疾病易感性和人體對疾病的抵抗力等方面發(fā)揮重要作用[7]。SNP是基因多態(tài)性中最常見的1種，已被列為對復雜性疾病產生影響的最主要因素之一[8]。已有研究證實，單個或多個基因的遺傳易感性會對CAD的發(fā)病產生直接影響，且不同地域、種族或同種族不同地域人口的CAD易感性具有差異[9]。全基因組關聯(lián)分析檢測到GUCY1A3基因座常見的非編碼區(qū)突變與CAD之間具有很強的關聯(lián)性[10]。GUCY1A3基因是編碼sGC的α1亞基，sGC是NO-sGC-cGMP信號轉導通路中的關鍵酶，大部分以α1/β1異二聚體的形式廣泛分布于許多實質臟器及各種組織細胞中[11]。當體內的sGC被NO激活，激活的sGC可以將GTP轉化為cGMP，后者則作為細胞內調節(jié)信息的傳遞者，介導舒張血管、降低血壓及促進Na+排泄等正常生理活動[12]。動物實驗研究也證明，若將大鼠的sGCα1、α2或sGCβ1基因敲除，其血管平滑肌舒張、血壓調節(jié)及血小板聚集等方面的功能均會較正常對照組產生不同程度的紊亂，部分會發(fā)生嚴重疾病，甚至死亡[13]。與之類似，心血管系統(tǒng)疾病患者體內的NO-sGC-cGMP信號通路也常為紊亂狀態(tài)，其根本原因是NO在病理狀態(tài)下被清除，導致通路中最重要的第二信使cGMP無法被正常激活，從而不能發(fā)揮其正常生理功能[14]。綜上，NO-sGC-cGMP通路在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中顯得尤為重要，其將成為多種心血管系統(tǒng)疾?。ㄈ绻谛牟?、心肌梗死、心力衰竭和慢性肺心病等）有效治療靶標[15]。

本研究結果顯示，入選的研究對象基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明所收集的樣本基本能代表延邊地區(qū)漢族人群GUCY1A3基因多態(tài)性分布。本研究中冠心病組GG基因型頻率高于對照組，而對照組GA+AA基因型頻率高于冠心病組，有差異。應用Logistic回歸分析排除年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓、舒張壓該混雜因素的作用后，有差異，與基因型為GA+AA者比較，基因型為GG者其患CAD的危險性增加，表明GG基因型很可能是延邊地區(qū)漢族人群冠心病發(fā)病的易感基因型。GUCY1A3基因位點rs7692387的A等位基因頻率分布在對照組中高于CAD組，而G等位基因頻率分布在CAD組中高于對照組，有差異。應用Logistic回歸分析排除年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙史、收縮壓及舒張壓該混雜因素的影響后，有差異，與攜帶G等位基因比較，攜帶A等位基因可降低冠心病的患病風險，表明A等位基因可能是延邊地區(qū)漢族人群冠心病的保護性基因。

本研究在一定程度上為冠心病易感人群的篩選及保護提供理論依據(jù)，從而根據(jù)不同個體的基因多態(tài)性實施針對性的早期干預，對冠心病的預防及個性化治療具有重要意義。同時由于國內外對GUCY1A3基因位點rs7692387的研究較少，該試驗的結果仍需在擴大樣本含量的基礎上，對不同種族、不同地域的人群進行更加深入的研究。

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