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(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院食品科學(xué)系,江蘇南京 210097; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇南京 210014; 3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095)

亞油酸(Linoleic acid,LA)是磷脂中主要的多不飽和脂肪酸,也是內(nèi)皮細(xì)胞中甘油三酯的重要組分[1-2]。在自由基誘導(dǎo)的自動(dòng)氧化或脂氧酶(LOX)作用下的氧化途徑中,LA首先被氧化為氫過氧化十八碳二烯酸(hydroperoxyoctadecadienoic acids,HPODEs)[3]。HPODEs不穩(wěn)定,可以降解形成含羥基、羰基等的一系列次級(jí)氧化產(chǎn)物。在谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)或Fe2+等作用下,HPODE被還原形成羥基十八碳二烯酸(HODEs)[4]。HODEs主要有兩種位置異構(gòu)體：9-HODE和13-HODE。9-HODE和13-HODE的比例與LA的氧化途徑密切相關(guān),自由基誘導(dǎo)的自動(dòng)氧化產(chǎn)生等量的9-HODE和13-HODE,而在LOX催化的氧化中二者的比例取決于LOX的來源,哺乳動(dòng)物的LOX催化LA氧化產(chǎn)生的HODEs以13-HODE為主[5]。研究表明,HODEs可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放白介素1β[6]，阻止細(xì)胞程序性死亡[7]，導(dǎo)致線粒體腫脹[8],體內(nèi)HODEs水平升高會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化,并與某些癌癥的發(fā)生或發(fā)展密切相關(guān)[9-11]。值得關(guān)注的是,HODEs廣泛存在于富含油脂、高溫加工或加工周期較長的食品中[12-13],在腌臘肉制品中含量尤其豐富[14]。雖然外源性HODEs是否具有同樣的病理生理學(xué)作用尚未可知,但已有研究證實(shí),膳食中13C標(biāo)記的羥基脂肪酸被攝入后,可不經(jīng)修飾直接進(jìn)入人體血液[15]。由此可見,腌臘肉制品中高含量的HODEs具有潛在的食品安全隱患。

目前,HODEs的分析主要應(yīng)用于病理生理學(xué)等研究領(lǐng)域。常用的檢測方法有:GC-MS[16-17]、酶聯(lián)免疫吸附分析[18-19]、放射免疫分析[20]、HPLC-UV[21-22]、LC-MS/MS[23-24]等。近年來,膳食中包括HODEs在內(nèi)的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物與人類多種疾病的關(guān)系越來越受到關(guān)注,其分析方法、形成規(guī)律及機(jī)理等已成為食品科學(xué)的一大研究熱點(diǎn)。對食品中的13-HODE和9-HODE同時(shí)進(jìn)行分析,可以完整地了解食品中的HODEs含量水平,為進(jìn)一步開展暴露評估提供數(shù)據(jù)。另一方面,由此得到的二者比例可用于評價(jià)亞油酸氧化中酶促氧化和非酶促氧化途徑的貢獻(xiàn),是研究腌臘肉制品中HODEs形成機(jī)制的重要內(nèi)容[4,21]。Püssa 等[13]和Song等[14]建立了肉制品中HODEs含量的LC-MS/MS分析方法。LC-MS/MS在靈敏度、準(zhǔn)確性等方面具有顯著的優(yōu)勢,但設(shè)備昂貴,難以在非專業(yè)分析實(shí)驗(yàn)室普及推廣。本文利用HODEs存在共軛雙鍵,在234 nm具有紫外吸收的特性,建立同時(shí)測定9-HODE和13-HODE的正相HPLC-DAD分析方法。方法操作簡便、快捷,具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確性,滿足腌臘肉制品9-HODE和13-HODE含量分析的要求,適于非專業(yè)化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

農(nóng)家臘腸、肉丁香腸及咸肉 購自附近農(nóng)貿(mào)市場;柴火臘肉、純?nèi)舛∠隳c、金字香腸、雨潤臺(tái)式香腸、蘇式香腸 購自BHG超市;雙匯特嫩方腿香腸、雙匯蒜蓉烤腸、雙匯臺(tái)式烤香腸、荷爾美加州香腸、荷爾美鮮嫩香腸 購自蘇果超市;標(biāo)準(zhǔn)品0.1 mg/mL 9-HODE及0.5 mg/mL 13-HODE 上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司;Sep-Pak C18固相萃取柱(500 mg/3 mL) 美國Waters公司;正己烷、異丙醇及乙酸 均為色譜純;其余試劑 均為分析純。

高效液相色譜Waters e2695 美國Milford公司,配有二極管陣列檢測器(DAD);Biofuge stratos高速離心機(jī) 德國Heraeus公司;T25高速勻漿機(jī) 德國IKA公司;氮吹儀 美國Organomation公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 吸取適量體積質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的13-HODE、0.1 mg/mL 9-HODE的標(biāo)準(zhǔn)溶液小心氮吹,用正己烷分別配制成濃度為20 μg/mL的儲(chǔ)備液。再取適量儲(chǔ)備液,配制13-HODE和9-HODE的系列混合工作溶液,濃度范圍分別為0.5～20 μg/mL和1～12.5 μg/mL,置于-40 ℃儲(chǔ)存,有效期為一個(gè)月。

1.2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

1.2.2.1 甲醇濃度對凈化效果的影響 用不同濃度甲醇水溶液(40%～90%,v/v)配制質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL的13-HODE,9-HODE的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取5 mL溶液過C18小柱(預(yù)先用3 mL甲醇、3 mL水進(jìn)行活化與平衡),然后再進(jìn)行甲醇(2 mL)洗脫,氮吹后正己烷(200 μL)溶解,并進(jìn)行色譜分析(每個(gè)濃度的甲醇水溶液做三個(gè)重復(fù))。

1.2.2.2 甲醇體積對凈化效果的影響 用40%(v/v)的甲醇水溶液配制質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL的13-HODE,9-HODE的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別吸取5 mL溶液過C18小柱(預(yù)先用3 mL甲醇、3 mL水進(jìn)行活化與平衡),然后分別選用不同體積的甲醇(0.5～3 mL)洗脫,氮吹后正己烷(200 μL)溶解,并進(jìn)行色譜分析(每個(gè)體積的甲醇水溶液做三個(gè)重復(fù))。

1.2.3 樣品處理 根據(jù)Song等[14]的方法,并作修改。將選購的腌臘肉制品切碎至均勻肉餡狀,裝入密封袋,置于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。稱取2 g樣品于80 mL離心管中,加入15 mL甲醇后5000 r/min均質(zhì)2 min,加水10 mL,混合均勻后3200 r/min離心10 min。吸取5 mL上清液過C18固相萃取柱(預(yù)先用3 mL甲醇、3 mL水進(jìn)行活化與平衡),然后用2 mL甲醇洗脫,洗脫液在30 ℃下氮吹至干,溶于200 μL正己烷(對于HODEs含量高的樣品,需根據(jù)HODE的含量增加正己烷用量,保證目標(biāo)分析物的濃度在線性范圍內(nèi)),過0.22 μm濾膜,用于色譜分析。

樣本處理換算公式:

HODE的含量(μg/g)=5c×v/2

其中,c為樣品中HODE的質(zhì)量濃度(μg/mL),v為氮吹后溶于正己烷的體積(mL),2為樣品的質(zhì)量(g),5為總樣品液與C18小柱上樣液的體積之比。

1.2.4 色譜條件 色譜柱:Lichrosorb Si 60(250 mm×4.0 mm,5 μm);流動(dòng)相:正己烷/異丙醇/乙酸(98∶2∶0.5,v/v/v);流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測器:二極管陣列(DAD),波長:234 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將13-HODE和9-HODE系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,進(jìn)行HPLC-DAD分析,每個(gè)濃度重復(fù)測定3次。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL)為x,以峰面積為y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算方法的檢出限和定量限,并根據(jù)樣本處理換算公式得到樣本的檢出限和定量限。

1.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 分別選用高、中、低HODEs含量的三種腌臘肉制品,按照1.2.3進(jìn)行樣品處理。日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn):在1 d內(nèi),樣品按6個(gè)重復(fù)進(jìn)行處理、并完成高效液相色譜分析;日間精密度實(shí)驗(yàn):每天按3個(gè)重復(fù)處理樣品，并完成高效液相色譜分析,連續(xù)進(jìn)行4 d。以測得的結(jié)果分別計(jì)算日內(nèi)和日間的精密度(以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示)。

1.2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 分別選用高、中、低HODEs含量的三種腌臘肉制品,進(jìn)行13-HODE和9-HODE的回收率實(shí)驗(yàn)。根據(jù)樣品中13-HODE和9-HODE的含量分別添加水平相近的13-HODE和9-HODE標(biāo)準(zhǔn)品,按1.2.3進(jìn)行處理,每個(gè)添加水平做3個(gè)重復(fù),測定其13-HODE和9-HODE的含量,計(jì)算兩種目標(biāo)分析物的回收率。

1.2.8 兩種方法同時(shí)檢測14種腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的含量 運(yùn)用本文建立的HPLC-DAD方法對14種腌臘肉制品中的13-HODE和9-HODE的含量進(jìn)行測定,同時(shí)根據(jù)Song等[14]的方法,采用LC-MS/MS對這幾種腌臘肉制品中的目標(biāo)分析物進(jìn)行測定,并對其測定結(jié)果進(jìn)行比較,進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS statistics 17.0進(jìn)行單因素方差分析與相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取條件的優(yōu)化

生物樣本中HODEs的分析檢測多采用溶劑萃取的方法,常用的提取溶劑有乙酸乙酯[21]、甲醇[16-17]、乙醚等[22,25]。因此,本文選擇乙酸乙酯、甲醇、乙醚等溶劑提取腌臘肉制品中的HODEs,并對提取效率進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,甲醇的提取效率最高。但腌臘肉制品富含蛋白、脂肪等,簡單的液液萃取難以有效去除這些雜質(zhì),影響HODEs的定性、定量分析。Pussa 等[13]和Song等[14]運(yùn)用固相萃取(SPE)進(jìn)行凈化,采用提取液直接過C18小柱的方法,可以滿足LC-MS/MS分析的要求。但這樣的SPE方法不適于本文建立的正相HPLC-DAD檢測方法。

為了優(yōu)化腌臘肉制品甲醇提取液中HODEs的固相萃取條件,本文利用HODEs標(biāo)準(zhǔn)溶液,觀察了不同濃度甲醇水溶液(40%～90%,v/v)對HODEs在C18小柱上保留的影響,結(jié)果如圖1。由圖1可看出,當(dāng)甲醇濃度大于65%(v/v)時(shí),溶液中的HODEs不能完全保留在C18小柱上。最終將提取液甲醇濃度調(diào)整至60%(v/v),然后離心、上樣,以確保樣品中的HODEs完全保留在C18小柱上。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了洗脫C18小柱上HODEs所需的最小甲醇使用量,結(jié)果如圖2。由圖2可知,當(dāng)洗脫液甲醇體積≥1.5 mL時(shí),均可將HODEs從C18小柱上洗脫下來,最終選擇2 mL甲醇用量以求完全洗脫HODEs。本文建立的腌臘肉制品中HODEs的C18小柱SPE凈化方法,最大限度的去除了雜質(zhì),較好地體現(xiàn)了SPE凈化、濃縮的特點(diǎn)。

圖1 甲醇濃度對回收率的影響Fig.1 Effects of methanol concentration on recovery rate

圖2 甲醇體積對回收率的影響Fig.2 Effects of methanol volume on recovery rate

2.2 色譜條件的優(yōu)化

HODEs具有共軛雙鍵,在234 nm具有的特征吸收使建立HODEs的HPLC-UV或HPLC-DAD分析方法成為可能。為了實(shí)現(xiàn)同時(shí)分析腌臘肉制品中的13-HODE和9-HODE,本文利用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液比較了二者在反相柱(C18柱)和正相柱(Si 60柱)的保留行為。當(dāng)選用C18柱時(shí),13-HODE和9-HODE的保留時(shí)間極為接近,先后采用等度和多種模式的梯度洗脫,都無法實(shí)現(xiàn)二者的完全分離。當(dāng)選用Si 60柱時(shí),二者在等度條件下即可以獲得完全分離。因此,本文選用Si 60柱作為色譜分離柱,在此基礎(chǔ)上對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。

基于腌臘肉制品成分復(fù)雜,本文參考文獻(xiàn)[16]選擇正己烷、異丙醇為主要成分構(gòu)成流動(dòng)相,觀察了兩者比例對雜質(zhì)和HODEs分離的影響。正己烷與異丙醇的比例顯著影響13-HODE和9-HODE的保留時(shí)間,HODEs的保留時(shí)間隨著異丙醇比例的增加而縮短,當(dāng)正己烷:異丙醇的比例為98∶2(v/v)時(shí),HODEs的保留時(shí)間適中,可與雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)基線分離。HODEs為含羥基的長碳鏈羧酸,流動(dòng)相pH影響對其保留行為也有影響。本文選擇乙酸降低流動(dòng)相pH,抑制HODEs的解離。在0.05%～1.2%(v/v)的范圍內(nèi),隨著乙酸的增加,HODEs的峰型逐步得到改善,但由于其截止波長(230 nm)與HODEs特征吸收波長234 nm相近,導(dǎo)致基線噪聲不斷上升,影響HODEs的靈敏度。因此,最終將乙酸濃度設(shè)定在0.5%(v/v)。

本文還觀察了流速、柱溫對HODEs在Si 60柱上保留的影響。流速、柱溫的提高均可以縮短HODEs的保留時(shí)間,提高分析效率,但過度的增加流速和柱溫也會(huì)影響HODEs與雜質(zhì)的分離,同時(shí)提升儀器系統(tǒng)壓力。綜合考慮,本文設(shè)定的流速為1 mL/min,柱溫為30 ℃。

表2 13-HODE的日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Intra-day precision of the method for determination of 13-HODE

表3 9-HODE的日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Intra-day precision of the method for determination of 9-HODE

在本文設(shè)定的色譜條件下,HODEs具有適中的保留時(shí)間(分別為7.12 min和9.22 min)和良好的峰型,與雜質(zhì)完全分離。圖1中的A和B分別是13-HODE和9-HODE混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖。

圖3 混標(biāo)與香腸樣品的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of HODEs in mixed standard solution and in sausage sample注:A:混標(biāo)1=13-HODE(5.0 μg/mL);2=9-HODE (10.0 μg/mL);B:肉丁香腸1=13-HODE (4.91 μg/g);2=-HODE(2.5 μg/g)。

2.3 線性范圍及最低檢測限

配制13-HODE和9-HODE濃度分別為0.5～20 μg/mL和1～12.5 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后進(jìn)行HPLC-DAD測定。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL)為x,其對應(yīng)的峰面積為y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999,由此可見在本文設(shè)定的范圍內(nèi),13-HODE和9-HODE 濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系。按照3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計(jì)算方法的檢出限和定量限,13-HODE和9-HODE的檢出限分別為0.075 μg/g和0.15 μg/g,定量限分別為0.25 μg/g和0.50 μg/g(見表1)。腌臘肉制品中HODEs的含量普遍高于1 μg/g,甚至高達(dá)100 μg/g以上[14]。因此,本文建立的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的分析方法可以滿足同時(shí)分析腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE含量的要求。

表1 方法的線性、檢出限以及定量限Table 1 The linearity,detection limits, quantification limits of the proposed method

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

本方法的精密度通過對高、中、低三種HODEs水平的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的日內(nèi)和日間實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評價(jià),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2～表5。13-HODE的日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.5%～2.7%和2.2%～2.5%,9-HODE日內(nèi)和日間RSD分別為1.6%～2.5%和2.3%～3.1%。由此可見,本文建立的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的分析方法具有較好的精密度。

表4 13-HODE的日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 4 Inter-day precision of the method for determination of 13-HODE(n=3)

表5 9-HODE的日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 5 Inter-day precision of the method for determination of 9-HODE(n=3)

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

本文通過添加回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。選擇高、中、低三種HODEs水平的腌臘肉制品,分別添加與其自身HODEs水平相近的13-HODE和9-HODE標(biāo)準(zhǔn)品,通過分析添加前后的樣品中HODEs的含量,計(jì)算回收率,結(jié)果見表6。

由表6可以看出,在3～15 μg/g的添加范圍內(nèi),13-HODE的回收率在83.3%～91.7%之間,平均回收率為88.2%;在1～6 μg/g 的添加范圍內(nèi),9-HODE的回收率在82.0%～89.2%之間,平均回收率為86.0%。由此可見,本文建立的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的分析方法具有較好的準(zhǔn)確性。

表6 分析物在不同添加水平的回收率(n=3)Table 6 Recoveries of the analytes at different spiked levels(n=3)

2.6 實(shí)際樣品分析

為了驗(yàn)證建立的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的HPLC-DAD分析方法,本文采集了附近農(nóng)貿(mào)市場、超市的14種腌臘肉制品,包括生制腌臘肉制品9種和即食腌臘肉制品5種,采用1.2.3的樣品前處理方法,并在1.2.4的色譜條件下對其中13-HODE和9-HODE的含量進(jìn)行了分析,結(jié)果見表7。

表7 實(shí)際樣品中13-HODE和9-HODE的含量(n=3)Table 7 Contents of 13-HODE and 9-HODE in practical samples(n=3)

從表7中可以看出,所有樣本都含有13-HODE和9-HODE,其中13-HODE的含量1.20～167.54 μg/g,9-HODE的含量0.63～139.20 μg/g。不同產(chǎn)品中的HODEs含量差異巨大,這一現(xiàn)象與Song等[14]的報(bào)道一致。腌臘肉制品種類繁多,原輔料以及加工工藝也大不相同。原料中脂質(zhì)含量、加工溫度、時(shí)間以及添加劑等對脂質(zhì)氧化程度及其產(chǎn)物都具有重要影響[26],這可能是導(dǎo)致不同腌臘肉制品中HODEs含量差異巨大的原因。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本文建立的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的分析方法,我們參考Song等[14]的方法,采用LC-MS/MS對上述腌臘肉制品中農(nóng)家臘腸、雙匯特嫩方腿香腸和荷爾美鮮嫩香腸中13-HODE和9-HODE的含量同時(shí)進(jìn)行了分析,兩種方法的結(jié)果列于表8。統(tǒng)計(jì)分析顯示,兩種方法的結(jié)果之間無顯著差異,進(jìn)一步表明本文建立的腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的分析方法具有優(yōu)良的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

表8 兩種測定方法檢測三種腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE的含量(n=3)Table 8 Contents of 13-HODE and 9-HODE in three practical samples(n=3)by two methods

本文通過樣本處理?xiàng)l件以及色譜條件的優(yōu)化,建立了同時(shí)測定腌臘肉制品中13-HODE、9-HODE的HPLC-DAD分析方法。腌臘肉制品中13-HODE和9-HODE用甲醇提取,經(jīng)固相萃取柱凈化濃縮,在Si 60色譜柱上進(jìn)行分離,流動(dòng)相為正己烷/異丙醇/乙酸(98∶2∶0.5,v/v),在234 nm對13-HODE、9-HODE進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,13-HODE、9-HODE分別在0.5～20、1.0～12.5 μg/mL的范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系(R2>0.999),檢出限分別為0.075、0.15 μg/g,定量限分別為0.25、0.50 μg/g,不同添加水平的平均回收率分別為88.2%,86.0%。對14種腌臘肉制品含量分析表明,所有樣本都含有13-HODE和9-HODE,含量分別在1.2～167.54、0.63～139.20 μg/g范圍內(nèi)。腌臘肉制品普遍含有羥基十八碳二烯酸,其形成規(guī)律及機(jī)理、膳食暴露等值得進(jìn)一步研究。

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