古麗斯坦·阿不來(lái)提，迪里木拉提·毛里明，姚 軍

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

錦雞兒，又名金雀花，屬豆科蝶形花亞科錦雞兒屬(CaraganachinensisiTurcz.exMaxim)植物[1-2]，全世界約有100余種，主要分布?xì)W洲和亞洲的干旱和半干旱地區(qū)，我國(guó)產(chǎn)有62種，9個(gè)變種，12個(gè)變型[3]，其中阿勒泰錦雞兒產(chǎn)于我國(guó)新疆阿勒泰山青河地區(qū)[4]。研究表明錦雞兒中主要含有黃酮類、甾體類、萜類、生物堿類等化學(xué)成分[5-9]；黃酮類化合物是其主要成分[10]。黃酮類化合物具有降血壓、抗肝毒性、抗炎、抗菌、抗病毒、抗痙攣等藥理作用，其作用機(jī)理與總黃酮的抗氧化活性密切相關(guān)[11-14]。本研究采用超聲提取法提取阿勒泰錦雞兒葉和花中的總黃酮，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，采用DPPH自由基、·OH自由基清除作用和銅離子還原能力試驗(yàn)評(píng)價(jià)阿勒泰錦雞兒葉和花中總黃酮的抗氧化能力，采用LC-MS對(duì)阿勒泰錦雞兒葉和花中主要黃酮類成分進(jìn)行化學(xué)成分分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1儀器AB135-S型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，T6型新世紀(jì)型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京慧龍環(huán)科環(huán)境儀器有限公司)，HH-S4型恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)，LCQ DECA XP MAX型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher 公司)，X-calibur工作站。

1.2試藥蘆丁對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)20150721)，無(wú)水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20160325)，二苯基苦基苯肼 (DPPH,上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)20161024)，新亞銅(上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)20161012)，醋酸銨(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20130412)，硫酸銅(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20141103)，抗壞血酸(天津歐博凱化工有限公司，批號(hào)20120812)，水楊酸(天津市天新精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20120911)，氫氧化鈉(天津永晟精細(xì)化工有限公司，批號(hào)20150916)，硝酸鋁(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)2011-34)，亞硝酸鈉(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20120106)，過(guò)氧化氫(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20111221)，試劑均為分析純。

1.3藥材阿勒泰錦雞兒全草2016年4月購(gòu)于新疆阿勒泰地區(qū)哈薩克醫(yī)院藥房，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定為豆科錦雞兒屬植物阿勒泰錦雞兒(CaraganaaltaicaKom.Pojark)的全草。

1.4方法

1.4.1 對(duì)照品溶液的配制 稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，用70%乙醇定容至50 mL容量瓶中，制得0.20 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液，冷藏，備用。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 量取蘆丁對(duì)照品溶液0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加入0.40 mL 5% NaNO2溶液，靜置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加入5.00 mL 4% NaOH溶液，用70%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻，靜置10 min，在510 nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁對(duì)照溶液的濃度為橫坐標(biāo)(C)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.017 1C-0.003 3(R2=0.999 9)。

1.4.3 錦雞兒總黃酮的超聲提取方法 將阿勒泰錦雞兒花干燥后粉粹過(guò)40目篩，稱取1.00 g，加入70%乙醇溶液30 mL，浸泡15 min，在70℃下超聲40 min，抽濾，冷卻至室溫，取1 mL置于10 mL容量瓶中，按“1.4.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

1.4.4 單因素考察試驗(yàn) 以阿勒泰錦雞兒花粉末為原料，設(shè)定超聲功率為300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶30，水浴溫度為60 ℃，超聲時(shí)間為40 min。固定其他條件，依次改變料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、超聲時(shí)間(20、30、40、50、60 min)，以總黃酮提取含量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)篩選各因素水平，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化各因素水平 在單因素考察基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken 響應(yīng)面以總黃酮的提取含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)方案，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.4.6 阿勒泰錦雞兒葉和花中總黃酮抗氧化活性研究

1.4.6.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 稱取20 mg DPPH試劑，用無(wú)水乙醇溶解并定容于250 mL容量瓶，配制成濃度為2×10-4mol/L的溶液。取5支具塞試管依次加入(濃度為0.006、0.012、0.018、0.024、0.03 mg/mL)樣品溶液各2 mL及DPPH溶液2 mL，無(wú)水乙醇1 mL使反應(yīng)總體積為5 mL，搖勻。遮光靜置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度(Ai)，計(jì)算清除率，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。式中：A0為無(wú)水乙醇2 mL+DPPH 2 mL+無(wú)水乙醇1 mL時(shí)的吸光度值；Aj為無(wú)水乙醇2 mL+待測(cè)樣品2 mL+無(wú)水乙醇1 mL時(shí)的吸光度值；Ai為待測(cè)樣品2 mL+DPPH 2 mL+無(wú)水乙醇1 mL時(shí)的吸光度值。

1.4.6.2 羥自由基清除能力測(cè)定 取5支具塞試管依次向其中加入2.0 mmol/L 的FeSO4溶液2.0 mL，1.0 mmol/L的 H2O22.0 mL，振蕩，搖勻，再加入6.0 mmol/L水楊酸3.0 mL，搖勻，于37℃水浴加熱15 min，在510 nm處測(cè)定吸光度(A0)，然后分別向5支試管中加入待測(cè)樣品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，再分別加入超純水0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL，搖勻，37℃下水浴加熱15 min，在510 nm處測(cè)定吸光度(Ax)，計(jì)算清除率。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6.3 銅離子還原能力的測(cè)定 分別取0.5 mL(濃度為0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 、4.8 mg/L)的樣品液，加入0.01 mol/L CuSO4和7.5 mmol/L新亞銅試劑各0.125 mL混合,再加入0.2 mol/L pH值為7.0的NH4Ac緩沖液至總體積為1.0 mL，搖勻，靜置30 min，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算還原百分率。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。式中：A0為不加樣品時(shí)的吸光度值；Amax為在系列樣品溶液中溶液濃度最高時(shí)的吸光度值；A為樣品在450 nm處的吸光度值。

相對(duì)總還原百分率/%=(A-A0)/(Amax-A0)

1.4.7 花和葉中黃酮類成分質(zhì)譜鑒定 色譜條件：Waters C18色譜柱(250 mm×3.0 mm，5 μm )；柱溫25℃；體積流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B)，梯度洗脫程序：0～25 min A：15%～50%。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源ESI，掃描范圍：100～1 100(m/z)，采用負(fù)離子檢出模式，干燥氣為N2，干燥氣溫度300℃，流速30 L/min，毛細(xì)管電壓30 V，霧化器壓力345 kPa，碰撞誘導(dǎo)解離電壓45 eV。

2 結(jié)果

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果在超聲溫度為60～65℃條件下(1)控制反應(yīng)條件：時(shí)間為40 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50時(shí)，超聲提取總黃酮的含量為10.30、13.81、14.74、15.43、15.55 mg/g，當(dāng)料液比為1∶50時(shí)，總黃酮含量最高。(2)控制反應(yīng)條件：時(shí)間為40 min，料液比為1∶50，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%時(shí)，超聲提取總黃酮的含量為16.63、17.42、17.81、19.36、19.41、18.84、16.0、11.72 mg/g，當(dāng)乙醇濃度增加到60%時(shí)提取含量開(kāi)始下降。(3)控制反應(yīng)條件：料液比為1∶50，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，超聲時(shí)間分別為20、30、40、50、60 min時(shí)，超聲提取總黃酮的含量為21.12、21.63、22.72、22.85、20.31 mg/g，當(dāng)超聲時(shí)間為50 min時(shí)總黃酮的含量最高。

2.2Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)分析以料液比(A)、提取時(shí)間(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)3個(gè)因素為自變量，總黃酮提取含量為響應(yīng)值，通過(guò)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)軟件Design-Expert8.0.6 對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到方差分析結(jié)果，見(jiàn)表3和圖1-3。通過(guò)多元回歸擬合分析得到金雀花中總黃酮提取含量(Y)與料液比(A)、超聲時(shí)間(B)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)之間的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=-0.032 313+(1.193×10-3)A+(1.617 5×10-4)B+(6.98×10-4)C+(1.25×10-6)AB-(7.5×10-7)AC+(2.5×10-6)BC-(1.36×10-5)A2-(2.35×10-6)B2-(6.35×10-6)C2。根據(jù)方差分析結(jié)果，回歸方程的P=0.005 8<0.01，表明試驗(yàn)所用的模型極為顯著，可進(jìn)行響應(yīng)值預(yù)測(cè)，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)的P=0.169 5，R2=0.912 5，模型對(duì)實(shí)際情況擬合良好。二次模型統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，各因素對(duì)總黃酮提取含量的影響大小順序?yàn)锽>C>A。通過(guò)軟件Design-Expert8.0.6 得出最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)為60%、料液比(A)1∶47.40、超聲時(shí)間(B)50 min；為操作可行，將料液比調(diào)整為1∶50。根據(jù)所得的條件進(jìn)行3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總黃酮平均提取含量為22.3 mg/g，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，證明該結(jié)果合理可靠。

表2 box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3阿勒泰錦雞兒花、葉、根、莖中總黃酮提取含量的測(cè)定在最佳提取工藝條件下測(cè)得阿勒泰錦雞兒不同部位中總黃酮的含量分別為：花22.3 mg/g，葉27.3 mg/g，根8.71 mg/g ，莖6.55 mg/g。

2.4抗氧化試驗(yàn)錦雞兒葉和花中總黃酮對(duì)DPPH自由基、·OH自由基的清除能力和銅離子還原能力隨著黃酮濃度的增大而增加。當(dāng)總黃酮濃度為0.04 mg/mL時(shí)葉和花對(duì)DPPH自由基清除率分別為79.7%、84.4%，相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照VC的清除率為90.3%；當(dāng)總黃酮濃度為3.2 μg/mL時(shí)葉和花對(duì)銅離子總還原百分率分別為85.4%、91.8%，相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照VC的清除率為96.3%；表明，隨著溶液濃度的升高，葉和花中總黃酮的DPPH自由基清除率和銅離子還原百分率逐漸緩慢接近于VC的清除率；當(dāng)總黃酮濃度為4.0 mg/L時(shí)葉和花對(duì)·OH自由基清除率分別為27.1%、30.5%，相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照VC清除率為71.2%、由此可知花和葉的·OH自由基的清除能力遠(yuǎn)小于VC的清除率，見(jiàn)圖4-6。

表3 多項(xiàng)式模型方差分析

注：顯著性，**P<0.01顯著，*P<0.05較顯著。

圖1 料液比與提取時(shí)間響應(yīng)面圖

圖2 料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)響應(yīng)面圖

圖3 提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)響應(yīng)面圖

2.5花和葉中黃酮類成分質(zhì)譜鑒定通過(guò)最佳提取工藝提取葉和花中總黃酮，利用質(zhì)譜鑒定得到花和葉的總離子流圖，見(jiàn)圖7-8。通過(guò)LC-MS鑒定花和葉樣品中黃酮類成分，錦雞兒花中有9種黃酮苷，葉中有8種黃酮苷，其花和葉中共有的為：槲皮素-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖-7-O-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖苷、蘆丁、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷。異鼠李素-3-O-葡萄糖苷只存在于葉中，而楊梅素-3-O-蕓香糖苷和異鼠李素-3-O-鼠李糖(1→2)鼠李糖(1→6)葡萄糖苷存在于花中?；ㄖ猩侥畏?3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖-7-O-鼠李糖苷和蘆丁的含量較高，葉中山奈酚-3-O-(二鼠李糖)-蕓香糖苷和蘆丁的含量較高，見(jiàn)表4。

圖4VC與葉、花中總黃酮的DPPH自由基清除能力

圖5VC與葉、花中總黃酮的銅離子還原能力

圖6VC與葉、花中總黃酮的·OH自由基清除能力

圖7錦雞兒花的總離子流圖

圖8錦雞兒葉的總離子流圖

表4 阿勒泰錦雞兒花與葉主要黃酮苷的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和鑒定結(jié)果

3 討論

楊申明等[15]采用回流提取法提取錦雞兒花，結(jié)果花中總黃酮含量為1.543mg/g，而本研究采用超聲提取法提取錦雞兒花和葉，結(jié)果花中總黃酮含量為22.3mg/g，葉中總黃酮含量為27.3mg/g。由于

加熱回流等傳統(tǒng)提取方法費(fèi)時(shí)、操作繁瑣，藥材長(zhǎng)期處于高溫狀態(tài)易發(fā)生氧化，超聲提取所需時(shí)間短，避免了藥材長(zhǎng)時(shí)間處于高溫下的氧化，從而使得產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量都得以提高[16]。本研究采用3種抗氧化試驗(yàn)評(píng)價(jià)阿勒泰錦雞兒葉和花中總黃酮的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)阿勒泰錦雞兒花中總黃酮含量低于葉中的總黃酮含量，但其抗氧化能力強(qiáng)于葉。采用LC-MS對(duì)阿勒泰錦雞兒葉和花進(jìn)行化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)阿勒泰錦雞兒葉和花中所含黃酮苷的種類相似，但花和葉中各種黃酮苷含量不同，由于不同種黃酮的抗氧化能力不同，因此盡管花中總黃酮含量低于葉，但其抗氧化能力強(qiáng)于葉。

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