劉 歡(LIU Huan)，張懷東(ZHANG Huai-dong)，陳曉暉(CHEN Xiao-hui)，龔 睿(GONG Rui)

(中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所，湖北 武漢 430071)

隨著人們認(rèn)識(shí)的增加，烈性傳染性病毒不斷被發(fā)現(xiàn)和鑒定，高致病性、高傳播性的病毒往往由于變異，導(dǎo)致反復(fù)流行。如在非洲和阿拉伯半島多次暴發(fā)1931年首次分離到的裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)[1]；1937年發(fā)現(xiàn)于非洲，并于1999年傳入美國(guó)且在多個(gè)州暴發(fā)的西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)[2-3]；1944、1956、1965年分別發(fā)現(xiàn)于俄國(guó)克里米亞、非洲剛果和我國(guó)新疆巴楚地區(qū)的克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus，CCHFV)，1967年分離出該病毒，被我國(guó)稱(chēng)為新疆出血熱病毒(Xinjiang haemorrhagic fever virus，XHFV)[4]。1967年在德國(guó)首次發(fā)現(xiàn)馬爾堡病毒(Marburgvirus，MARV)[5]；1976年發(fā)現(xiàn)，隨后在非洲反復(fù)暴發(fā)流行的埃博拉病毒(Ebolavirus，EBOV)[6]；1998—1999年在馬來(lái)西亞暴發(fā)，2001—2009年連續(xù)在印度和孟加拉國(guó)流行的尼帕病毒(Nipahvirus，NiV)[7-8]；2002年底出現(xiàn)，2003年在我國(guó)暴發(fā)流行的SARS冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)[9]；2012年出現(xiàn)于沙特阿拉伯，具有高致死率的中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)[10]；2013年在我國(guó)多地出現(xiàn)的H7N9型流感病毒[11]。自2009年以來(lái)，中國(guó)加強(qiáng)了急性發(fā)熱性疾病的監(jiān)測(cè)與管理，發(fā)現(xiàn)了一種不明原因的嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)，該病由一種新型病毒引起，命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒，簡(jiǎn)稱(chēng)新布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome visus，SFTSV)[12]。目前，上述病毒感染幾乎沒(méi)有特效藥物和疫苗，因此，針對(duì)其研制特效藥物，對(duì)于提高其防治水平、保障我國(guó)國(guó)民健康，具有非常重要的意義。

1 克里米亞-剛果出血熱病毒

克里米亞-剛果出血熱最初源于20世紀(jì)40年代中亞克里米亞半島，病原體為CCHFV?？死锩讈?剛果出血熱是一種流行于俄國(guó)北部、中東、南部歐亞大陸和非洲撒哈拉地區(qū)的烈性傳染性疾病，主要見(jiàn)于無(wú)樹(shù)的大平原、半沙漠地帶及丘陵地區(qū)，病死率為20%～70%[13]，該病分布具有明顯的地域性[14-18]。1965年在我國(guó)新疆南部巴楚地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)此種疾病，CCHFV在我國(guó)又被稱(chēng)為XHFV。新疆出血熱是目前我國(guó)發(fā)現(xiàn)的四種蟲(chóng)媒病毒性傳染病之一[18]。在青海、云南、四川、內(nèi)蒙、安徽、海南、伊犁、東北等地均有抗體陽(yáng)性案例的報(bào)道，并證實(shí)在新疆塔里木盆地、準(zhǔn)噶爾盆地、塔里木河，云南騰沖、尋甸、西雙版納和孟連、伊犁河谷邊境地區(qū)、青海等存在XHFV自然疫源地[19]。近年來(lái)，新疆出血熱在我國(guó)再度暴發(fā)，疫區(qū)不斷擴(kuò)大，危害日益嚴(yán)重。CCHFV屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)的內(nèi)羅病毒屬(Nairovirus)[20]。根據(jù)第七屆國(guó)際病毒學(xué)分類(lèi)委員會(huì)報(bào)告，內(nèi)羅病毒屬包括34種由硬蜱科(Ixodidae)或者隱喙蜱科(Argasidae)傳播的病毒，分為七個(gè)血清型[21]，其中最重要的是克里米亞-剛果出血熱血清型和內(nèi)羅畢羊病(Nairobi sheep disease)血清型。內(nèi)羅畢羊病毒主要感染綿羊和山羊，也可以引起人輕度發(fā)熱和血小板減少[22]。

1968 年Murphy等[23-24]第一次描述了CCHFV在乳鼠腦中具有與其他布尼亞病毒科病毒相似的形態(tài)。在病毒基本結(jié)構(gòu)、形態(tài)發(fā)生、復(fù)制循環(huán)以及理化性質(zhì)等方面，CCHFV可作為布尼亞病毒科的典型代表[20, 25-28]。CCHFV基因組由大(L)、中(M)、小(S)三股負(fù)鏈 RNA 片段組成，分別編碼RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)、糖蛋白(glycoprotein，GP)及核蛋白(nucleoprotein，NP)[29]。三個(gè)基因組分別包含一個(gè)開(kāi)放讀碼框，兩側(cè)為非編碼區(qū)。每個(gè)基因組末端11個(gè)堿基是保守的，并且除第9位核苷酸外均互補(bǔ)，在隨后的20個(gè)左右堿基顯示片段特異性互補(bǔ)，形成螺絲狀或鍋柄狀結(jié)構(gòu)[30]。

CCHFV mRNA編碼的糖蛋白前體，經(jīng)翻譯后加工成為成熟的G1和G2[31-33]。成熟的G1和G2嵌入脂質(zhì)層，形成刺突狀結(jié)構(gòu)[34]。蛋白G1和G2也分別稱(chēng)為Gc和Gn，在介導(dǎo)病毒與受體結(jié)合，進(jìn)入宿主細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，病毒感染后產(chǎn)生的中和性抗體也主要靶向該區(qū)域[35]。成熟的糖蛋白能識(shí)別易感宿主細(xì)胞上的受體并能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生[36]。Gn只在病毒成熟的末期產(chǎn)生，目前研究[37]認(rèn)為，Gn主要起分子伴侶作用，幫助Gc正確折疊，而Gc介導(dǎo)了與受體的結(jié)合，其潛在受體可能是核仁素(nucleolin)。

CCHFV由蜱蟲(chóng)叮咬傳播，重癥患者的血液與排泄物也具有傳染性。該病毒具有傳播迅速、致死率高、暫無(wú)有效治療藥物[35, 38-39]等特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)針對(duì)CCHFV的特效藥物，對(duì)于提高我國(guó)對(duì)該病毒的防治水平，保障國(guó)民健康具有十分重要的意義。

2 治療性抗體

生物治療中的蛋白質(zhì)類(lèi)大分子藥物通常包括生長(zhǎng)因子、受體、酶、血液因子、抗凝血?jiǎng)⒅亟M疫苗、融合蛋白和單克隆抗體等，而單克隆抗體則越來(lái)越受到人們的關(guān)注[40]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已經(jīng)批準(zhǔn)三十多種單克隆抗體用于治療各種疾病，如癌癥、免疫系統(tǒng)疾病等[41]。2001年以來(lái)，治療性抗體的市場(chǎng)以每年35%的速度增長(zhǎng)，是生物類(lèi)藥物中增長(zhǎng)最快的[19]。近年來(lái)，一些大的制藥公司也在收購(gòu)其他抗體公司方面展開(kāi)激烈競(jìng)爭(zhēng)，如AstraZeneca公司于2007年花156億美元巨資買(mǎi)下MedImmune公司，而后者的主打產(chǎn)品之一是一種預(yù)防呼吸道合胞病毒感染的單克隆抗體Palivizumab(商品名Synagis)[42]，由此可見(jiàn)治療性抗體的重要性。

治療性抗體的顯著優(yōu)勢(shì)是其天然存在于人體內(nèi)，相對(duì)安全，同時(shí)具有功能強(qiáng)大和靶向性高的特點(diǎn)，為治療目前難以攻克的疾病帶來(lái)新的希望。如最近鑒定一系列針對(duì)人免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)的具有廣譜中和活性的抗體(如VRC01[43-44])，有的已進(jìn)入一、二期臨床試驗(yàn)(如PRO140[45-46]和TNX-355[47-48])，顯示出治療性抗體在防治HIV-1上具有很好的應(yīng)用前景[49-50]。

然而，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)抗體的分子量較大(～150 kD)，組織(如實(shí)體瘤)滲透性較差，也難以結(jié)合一些空間上有位阻效應(yīng)的關(guān)鍵表位(如病毒囊膜蛋白上的中和性位點(diǎn))，從而影響活性。解決的策略之一是將全長(zhǎng)抗體進(jìn)行小型化[51]，由此開(kāi)發(fā)了一系列具有結(jié)合功能的抗體片段，如Fab(50～60 kD)、單鏈抗體(scFv，20～30 kD)、重鏈可變區(qū)抗體(VH，12～15 kD)(單域抗體)等小型化抗體。上述抗體片段相對(duì)于全長(zhǎng)單抗，具有更好的組織滲透性和結(jié)合存在位阻效應(yīng)的抗原表位的能力，有些甚至能夠口服用藥。目前，基于人重鏈可變區(qū)VH的單域抗體已經(jīng)被用于研發(fā)針對(duì)病毒的候選抗體類(lèi)藥物[48, 51]。已有開(kāi)發(fā)以抗體Fc片段的CH2結(jié)構(gòu)域?yàn)楣羌艿膯斡蚩贵w，稱(chēng)之為納米抗體。該納米抗體的分子量與VH形式的單域抗體相似，但是具有相對(duì)較長(zhǎng)的血漿半衰期[52]。

已有研究[53]表明，病毒感染后產(chǎn)生的抗體對(duì)CCHFV具有中和作用，并且主要靶向病毒的囊膜蛋白。因此，通過(guò)抗體工程技術(shù)篩選出針對(duì)該病毒囊膜蛋白具有中和活性的單域抗體dAb或者nAb，有望開(kāi)發(fā)成一類(lèi)新的抗CCHFV的候選抗體藥物。

3 中和活性評(píng)價(jià)系統(tǒng)

皰疹口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)是典型的帶有包膜蛋白的動(dòng)物病毒，由于其龐大的宿主范圍，并能在很多哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞中穩(wěn)定地復(fù)制，被廣泛地應(yīng)用于研究中。VSV組裝使用時(shí)是刪除了糖蛋白G基因的重組VSV。重組rVSV-ΔG與異源病毒包膜蛋白一起生成VSV假病毒顆粒[54]。已有研究構(gòu)建了以VSV為基礎(chǔ)的假病毒體系VSV-CCHFVG[55]。首先在293FT細(xì)胞內(nèi)分別表達(dá)CCHFV糖蛋白前體G和β-半乳糖苷酶(作為對(duì)照)，然后用帶有螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒糖蛋白(VSV-VEEVGP，Venezuelan equine encephalitis virus glycoprotein)假病毒侵染細(xì)胞。委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒糖蛋白VEEVGP在細(xì)胞內(nèi)很快降解，VSV核心復(fù)制、組裝的子代病毒將帶有CCHFV糖蛋白，形成VSV-CCHFVG假病毒。侵染48 h后收集病毒，加入到SW13單層細(xì)胞中，通過(guò)測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶酶活性評(píng)估病毒的滴度。在缺少高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室的情況下，CCHFV模型的建立使得體外穩(wěn)定、高效地獲得感染性病毒顆粒并用于中和抗體的檢測(cè)與評(píng)價(jià)成為可能。

4 囊膜蛋白分類(lèi)與抗原設(shè)計(jì)

目前，依據(jù)病毒囊膜蛋白融合前后的結(jié)構(gòu)模式，將病毒囊膜蛋白分為三類(lèi)：ClassI、ClassII和ClassIII。ClassI型囊膜蛋白分類(lèi)的依據(jù)主要是其均能形成一個(gè)含有α-螺旋的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)中心的發(fā)夾三聚體；ClassII型囊膜蛋白分類(lèi)的依據(jù)主要是其均能形成含有β-折疊結(jié)構(gòu)的發(fā)夾三聚體[56-64]。ClassIII型囊膜蛋白也能通過(guò)兩部分結(jié)構(gòu)的組合，形成發(fā)夾三聚體(與ClassI型囊膜蛋白類(lèi)似)，融合后的三聚體也含有α-螺旋三聚體核心；然而每個(gè)融合區(qū)域暴露出兩個(gè)位于延長(zhǎng)的β-折疊頂端的融合環(huán)，顯著的表現(xiàn)出與ClassII型囊膜蛋白結(jié)構(gòu)上的類(lèi)似之處[65-67]。已有預(yù)測(cè)研究[64,68]表明，CCHFV的囊膜蛋白Gc屬于ClassII型囊膜蛋白。雖然這類(lèi)蛋白缺少明顯的保守氨基酸序列，但是其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)是保守的，結(jié)構(gòu)非常相似。

使用TMHMMServer(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預(yù)測(cè)CCHFV囊膜蛋白Gc在胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的分布?？缒^(qū)和胞內(nèi)區(qū)因存在空間位阻，不能成為其功能性表位。然后用NetNGlyc對(duì)囊膜蛋白糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，糖基化對(duì)表位形成有一定影響，可能會(huì)改變或形成新的表位。利用兩個(gè)抗原表位預(yù)測(cè)服務(wù)器，(1)ClusPro: protein-protein docking/Antibody Mode(http://cluspro.bu.edu)；(2)MIF Bioinformatics: Predicted Antigenic Peptides(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html)，聯(lián)用親水性、柔韌性、可及性、轉(zhuǎn)角等多參數(shù)進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)。綜合考慮跨膜區(qū)和抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果及囊膜蛋白的高度變異區(qū)，確定分段表達(dá)策略，逐步縮小抗原表位區(qū)域。表達(dá)、純化這些結(jié)構(gòu)域，可以作為抗體篩選的靶點(diǎn)。

5 展望

中和性抗體是烈性病毒感染防控的特效藥物，如已經(jīng)研制出的針對(duì)EBOV的抗體藥物ZMapp，取得了很好的效果。目前，已有的針對(duì)烈性病毒的中和抗體多為全長(zhǎng)單克隆抗體(主要為IgG形式)，分子量大，不容易結(jié)合大分子(如病毒囊膜蛋白)上空間存在位阻效應(yīng)的關(guān)鍵表位；而且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，制備周期長(zhǎng)，一般情況下需要在低溫儲(chǔ)存，難以適用于復(fù)雜環(huán)境。

相對(duì)于全長(zhǎng)克隆抗體、Fab和scFv，單域抗體(包括dAb和nAb)能更有效靶向病毒囊膜蛋白上那些關(guān)鍵而狹小的保守區(qū)域，發(fā)揮中和活性；富含β折疊，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單可原核表達(dá)，易于制備，常溫下仍保持穩(wěn)定，適宜在復(fù)雜的環(huán)境中儲(chǔ)存和使用；篩選能夠中和CCHFV的單域抗體，有望開(kāi)發(fā)出抗CCHFV的新候選藥物，單域抗體具有廣闊的應(yīng)用前景。