陳建國 袁繼芳 姜同仁 錢 峰

(1.安徽財經(jīng)大學(xué) 體育教學(xué)部, 安徽 蚌埠 233000 : 2.上海交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)部, 上海 200025)

哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，由免疫系統(tǒng)中的淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞以及上皮細胞共同參與的復(fù)雜炎癥病理過程[1]。在變應(yīng)原(過敏原)的作用下，患者出現(xiàn)支氣管反應(yīng)性增加、粘液產(chǎn)生增多、氣道壁重塑和氣道腔縮小等氣道高反應(yīng)性變化，從而導(dǎo)致短時間內(nèi)呼吸困難、哮鳴和胸部壓迫感[2]。哮喘屬于當今社會高發(fā)疾病，每10位兒童或12位成年人中就有1位是哮喘患者。在世界范圍內(nèi)，有超過3億的哮喘發(fā)病人群，僅在美國，用于該疾病的總花費每年就超過180億美元[3]。臨床上，皮質(zhì)類固醇和β腎上腺素能激動劑可以短期控制癥狀，但是這些藥物的長期使用，極易產(chǎn)生耐受。除此之外，約有5%-10%嚴重哮喘患者對現(xiàn)有藥物耐受，無法治愈[4-5]，全球每年約有49萬人因哮喘而喪生[6]。隨著空氣污染等環(huán)境因素變化，哮喘發(fā)病率在逐年增加，預(yù)計2025年患病人數(shù)將達到4億[5]。因此，尋找并發(fā)現(xiàn)潛在的哮喘預(yù)防方法及治療藥物，有效提高病人的生活質(zhì)量，顯得迫在眉睫，也極具藥物開發(fā)的商業(yè)價值。

近年來對運動的研究已延伸到通過運動促進健康、預(yù)防和治療疾病等方面[7]。其中，運動在炎癥性疾病中的作用備受關(guān)注。越來越多的研究表明，不同強度的運動對慢性炎癥具有調(diào)控作用[8-13]，且有文獻報道，定期有氧運動可改善肺功能，顯著改善哮喘癥狀，提高患者健康相關(guān)的生活質(zhì)量[14-15]?；诖耍狙芯款A(yù)先對小鼠進行游泳訓(xùn)練，并采用Dust mite誘導(dǎo)小鼠哮喘模型，通過分析哮喘性炎癥的嚴重程度探討游泳運動在哮喘中的作用，為哮喘的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/C雄性小鼠24只(購自上海斯萊克實驗動物有限公司)，8-12周齡，體重25±3 g。1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機分為對照組和運動訓(xùn)練對照組，每組12只。實驗小鼠自由飲食、飲水，小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20-25℃，濕度55%，12小時循環(huán)光/暗周期。

1.2 動物訓(xùn)練方案

小鼠運動方案結(jié)合預(yù)實驗經(jīng)驗，訓(xùn)練組小鼠施加6周無負重游泳訓(xùn)練。第一周的訓(xùn)練時間是30分鐘/天，第2-3周的訓(xùn)練時間是45分鐘/天，第4-6周以60分鐘/天進行訓(xùn)練。每周訓(xùn)練6天，中間休息一天。水溫為33±1 ℃，水深50厘米。

1.3 誘導(dǎo)劑的配制

Dust mite鋁劑佐劑的配制：將Dust mite溶于PBS，濃度為0.5 mg/mL，再將其與鋁劑以體積比1：19進行混合，4 ℃混懸儀上混合0.5小時以上，得Dust mite與鋁劑的混合物。鼻內(nèi)給予Dust mite的配制：將Dust mite溶于PBS，配置成濃度為8.5 mg/mL的濃儲(50×)，使用前用PBS稀釋。

1.4 Dust mite誘導(dǎo)小鼠哮喘模型的建立

動物訓(xùn)練結(jié)束后，將上述對照組和運動訓(xùn)練組小鼠再進一步分組，其中對照組隨機分為PBS對照組(A，n=6)和Dust mite對照組(B，n=6)，運動訓(xùn)練組隨機分為運動訓(xùn)練對照組(C，n=6)和Dust mite運動訓(xùn)練組(D，n=6)。游泳運動結(jié)束24 h后，戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)小鼠，使用Dust mite誘導(dǎo)哮喘模型，其中B組和D組在第0天和第5天腹腔給予Dust mite和鋁劑佐劑(200 μL/只)，模型組第12、13、14天再次鼻內(nèi)給予Dust mite(50 μL/只/天)進行免疫攻擊，A組和C組相對B組和D組分別給予PBS，各組均在第15天處理小鼠。

1.5 主要試劑

蘇木素伊紅染色液購自武漢博士德生物工程有限公司；ELISA試劑盒(IL-4和IL-5)購自美國R&D公司；IgE檢測試劑盒購自eBioscience公司；鋁劑佐劑購自美國Thermo Fisher scientific；其他試劑均購自美國Sigma公司。

1.6 實驗取材與指標檢測

1.6.1 實驗取材

運動訓(xùn)練結(jié)束并構(gòu)建Dust mite誘導(dǎo)哮喘模型15天后，麻醉小鼠，待小鼠充分昏迷后，用生物膠帶將小鼠以仰臥姿勢固定于操作臺上。用75%酒精溶液擦拭小鼠頸部及腹部皮膚進行消毒，用滅菌的手術(shù)剪沿腹中線剪開皮膚，將皮膚與腹膜剝離，同樣的方法剪開腹膜，找到胸腔，用眼科手術(shù)剪戳破橫膈膜，剪開胸骨，暴露小鼠心肺，用1 mL注射器抽取小鼠心臟血，隨后剝離小鼠頸部皮膚、肌肉及氣管周圍的平滑肌，暴露氣管并剪開小口，插入平頭針并用手術(shù)線固定平頭針，向其中緩慢注射0.6 mL DPBS，停頓數(shù)秒后，將DPBS從小鼠肺組織中抽出于EP管中，再重新吸取DPBS注射，重復(fù)3次，收集肺灌洗液(BALF)于EP管中，放于冰上。將腹主動脈剪開，迅速向右心室中注射10mL的PBS，將肺組織中殘留的血液沖洗干凈。將其中4葉小肺結(jié)扎，并剪下置于液氮中凍存，右側(cè)大肺則用注射器吸取0.6 mL的4%多聚甲醛溶液，緩慢沿平頭針注射進入小鼠氣管中，將肺組織充滿，拔出平頭針的同時，迅速扎緊手術(shù)縫合線。小心將肺葉剪下，浸泡于4%多聚甲醛中。

1.6.2 小鼠肺組織病理染色(H&E染色)

4%多聚甲醛溶液固定左肺24 h后，將組織依次浸入80%、95%I、95%II、100%I和100%II乙醇溶液各1小時脫水，然后浸入二甲苯溶液I、II分別透明30分鐘，再入蠟缸I、II、III分別浸蠟1小鼠，再將組織包埋制成蠟塊。蠟塊放入-20 ℃冰箱半小時后切片，厚度為4 μm。將切好的組織貼在載玻片上，置于65-70 ℃烘箱烤片30分鐘-1小時后，經(jīng)100%、95%、90%、80%、70%酒精脫蠟并放于蒸餾水。隨后將切片浸入蘇木精染液內(nèi)染色5-10分鐘，自來水沖洗，用1%鹽酸乙醇溶液分化透明，再用1%氨水溶液返藍，浸入伊紅溶液2-5分鐘，自來水沖洗，然后70%、80%、95%I、95%II、100%I、100%II、二甲苯I和二甲苯II溶液各3分鐘，待晾干后，用中性樹脂封片，置于顯微鏡下觀察拍照。

1.6.3 小鼠外周血血漿IgE含量檢測

在最后一次鼻內(nèi)刺激24 h后，麻醉小鼠，收集外周血，離心(3000 rpm，4 ℃，15 min)后收集血漿，參照eBioscience公司IgE試劑盒說明書檢測血漿中IgE的含量。

1.6.4 小鼠肺盥洗液中Th2型細胞因子含量檢測

在最后一次鼻內(nèi)刺激24 h后，收集肺盥洗液并離心(500 g，4 ℃，5 min)，使用IL-4和IL-5 ELISA試劑盒，按照試劑盒說明書測定肺盥洗液上清中IL-4和IL-5的含量。

1.7 統(tǒng)計分析

本研究各數(shù)據(jù)結(jié)果均采用means ± S.D的方法，統(tǒng)計分析軟件為Graphpad Prism 5，采用T檢驗進行結(jié)果分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 游泳運動降低Dust mite誘導(dǎo)小鼠肺組織病理損傷程度

由于在哮喘的發(fā)生過程中會有較多的嗜酸性粒細胞等細胞的募集和浸潤，組織中的細胞會明顯增加。因此，在Dust mite誘導(dǎo)后小鼠的肺組織中會有較多炎性細胞的浸潤，通過H&E染色(圖1)可以看到，在Dust mite誘導(dǎo)后小鼠肺組織中炎性細胞浸潤較PBS對照組明顯增多，說明Dust mite誘導(dǎo)小鼠肺部產(chǎn)生的炎性變化，而運動訓(xùn)練組較Dust mite對照組炎性細胞的浸潤顯著減少，同時PBS對照組與運動訓(xùn)練對照組無明顯差異。這一結(jié)果說明，運動訓(xùn)練可以改善Dust mite誘導(dǎo)的哮喘性炎癥發(fā)生的嚴重程度。

圖1 小鼠肺組織H&E染色結(jié)果示意圖

2.2 運動訓(xùn)練抑制Dust mite誘導(dǎo)小鼠血漿中IgE的產(chǎn)生

哮喘是Th2細胞介導(dǎo)的氣道過敏性炎癥反應(yīng)，在過敏原刺激下，IgE產(chǎn)生增加。在最后一次刺激24 h后，收集外周血上清，檢測其IgE含量，結(jié)果表明，PBS對照組與運動訓(xùn)練PBS組無明顯差異，而Dust mite對照組IgE產(chǎn)生量明顯升高，運動干預(yù)后，血漿中IgE含量較Dust mite對照組顯著降低，如圖2所示。這一結(jié)果表明，運動訓(xùn)練可減輕Dust mite引起的哮喘的發(fā)生發(fā)展。

2.3 游泳運動改善Th2型細胞因子的產(chǎn)生

在過敏原刺激下，小鼠哮喘發(fā)生過程中伴隨著Th2細胞因子的產(chǎn)生，包括IL-4和IL-5等。如圖3和圖4所示，在過敏原Dust mite誘導(dǎo)下，肺盥洗液中IL-4和IL-5的含量較PBS對照組顯著增多，而這一現(xiàn)象伴隨著游泳運動的干預(yù)有所減少，說明運動訓(xùn)練可改善Dust mite誘導(dǎo)的Th2型細胞因子的產(chǎn)生，提示游泳運動可緩解哮喘的發(fā)生，并通過減少Th2型細胞因子的產(chǎn)生減低哮喘發(fā)生的嚴重程度。

圖3 運動訓(xùn)練緩解Dust mite誘導(dǎo)的IL-4的產(chǎn)生(注：與Dust mite對照組相比，*表示P<0.05)

圖4 酶聯(lián)免疫吸附檢測肺盥洗液中IL-5含量示意圖(注：與Dust mite對照組相比，*表示P<0.05)

3 分析與討論

隨著人類生活水平的提高及運動的普及，科學(xué)家們對運動的研究也越來越深入，運動與疾病之間的聯(lián)系也越來越清晰。近年來的研究表明，不同強度的運動對慢性炎癥具有調(diào)控作用[8-13]。游泳作為奧運項目之一，深受廣大人民群眾的喜愛，加上中國健兒在游泳項目上的突破，越來越多的中國人參與到該項運動中來。游泳運動不僅可以強身健體，且可緩解疾病的發(fā)生，已有研究表明，游泳可降低糖尿病大鼠炎癥反應(yīng)、慢性炎癥反應(yīng)等[16-19]。但是游泳在哮喘中的作用尚不清楚。因此，本研究探討游泳運動在Dust mite誘導(dǎo)的哮喘性炎癥中的作用，以期為哮喘的防治和治療提供新方法。

為探討游泳運動在哮喘性炎癥中的作用，本研究對游泳訓(xùn)練組小鼠預(yù)先采用6周游泳訓(xùn)練，隨后構(gòu)建小鼠哮喘模型。對小鼠哮喘模型的構(gòu)建，科研中存在多種方法，本研究中采用Dust mite作為誘導(dǎo)劑，構(gòu)建了小鼠哮喘模型，模擬臨床哮喘的發(fā)生。在哮喘的發(fā)生過程當中，多種免疫細胞參與其中，肺部存在大量炎性細胞的聚集，尤以嗜酸性粒細胞為主。本實驗結(jié)果顯示，Dust mite誘導(dǎo)小鼠后，肺組織中存在明顯炎性細胞的浸潤，說明Dust mite可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生哮喘性炎癥，同時，游泳訓(xùn)練干預(yù)后Dust mite誘導(dǎo)的炎性細胞浸潤顯著減少。這一現(xiàn)象說明，游泳運動可改善哮喘發(fā)生的嚴重程度。

哮喘是Th2細胞介導(dǎo)的慢性肺部炎癥性疾病，在哮喘的發(fā)生過程中，當I型上皮細胞受損，可以釋放白介素-25(IL-25)和白介素-33(IL-33)等細胞因子[13,20]調(diào)節(jié)嗜酸性粒細胞(eosinophil)、T細胞和固有淋巴細胞(innate lymphoid cell, ILC)等免疫細胞功能，誘導(dǎo)IL-4、IL-5、IL-13、IL-9、IL-17、CCL17、CCL22和CCL11等細胞因子和趨化因子分泌[3]。其中，IL-4和IL-5是哮喘發(fā)生過程中兩類重要的細胞因子，可使嗜酸性粒細胞募集，并促使杯狀細胞增生產(chǎn)生包括MUC5AC及MUC5等黏液阻塞氣道腔，同時可以活化B細胞產(chǎn)生較多的IgE, 促進哮喘的發(fā)生[13]。

免疫球蛋白IgE存在于血中，是過敏反應(yīng)的介質(zhì)，為過敏反應(yīng)的核心物質(zhì)，在哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中其產(chǎn)生量顯著增加[21]。抑制IgE的產(chǎn)生可緩解哮喘的發(fā)生，甚至已有IgE抗體被開發(fā)用于哮喘的治療[22]。這些事實均說明IgE含量是哮喘發(fā)生過程中的重要指標。本研究通過對血漿中IgE含量檢測，發(fā)現(xiàn)Dust mite對照組中IgE含量明顯增高，而在游泳運動干預(yù)后，IgE含量顯著下降。這說明游泳運動可緩解哮喘的發(fā)生發(fā)展。

此外，由于IL-4和IL-5是哮喘發(fā)生過程中兩類重要的細胞因子，本研究也對各實驗組小鼠肺盥洗液中細胞因子的含量進行了檢測。實驗結(jié)果顯示，Dust mite對照組IL-4和IL-5含量較PBS組均明顯升高，且游泳運動Dust mite組該兩類細胞因子的含量均較對照組顯著降低。這表明，IL-4和IL-5分泌量增加，參與Dust mite誘導(dǎo)的小鼠哮喘，同時游泳運動可能通過減少IL-4和IL-5的產(chǎn)生發(fā)揮抑制哮喘的作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，游泳運動可以緩解Dust mite誘導(dǎo)的小鼠肺組織中炎性細胞的浸潤、降低血漿中IgE的產(chǎn)生，從而改善了Dust mite誘導(dǎo)的哮喘，這一作用可能是通過下調(diào)Th2 型細胞因子IL-4和IL-5的產(chǎn)生而引起的。該研究結(jié)果提示，游泳作為一種健康的運動方式，可以有效地預(yù)防和改善疾病的發(fā)生發(fā)展，為哮喘的預(yù)防和治療提供新方向。

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