姚明珠，李俊蘭，賴洪濤

(梅州市人民醫(yī)院風(fēng)濕皮膚科1、皮膚科2，廣東梅州514000)

尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是因?yàn)槿轭^瘤空泡病毒(human papillomavirus，HPV)A屬感染導(dǎo)致的外陰以及肛門周圍等出現(xiàn)疣狀增生性損傷，屬于性病中發(fā)病率最高的疾病[1]。經(jīng)檢測人乳頭瘤空泡病毒結(jié)構(gòu)主要為一種直徑為50 nm左右的環(huán)狀雙鏈無包膜DNA，大概有8 kb[2]。根據(jù)DNA結(jié)構(gòu)上L1區(qū)保守序列編碼不同可以將HPV分為很多亞型，目前經(jīng)證實(shí)的HPV亞型有將近100多種亞型，其中有將近40多種亞型與人生殖道感染有密切關(guān)系[3]。研究發(fā)現(xiàn)，不同的基因型HPV感染后對人體生殖器官受損程度不一，故患者預(yù)后往往不同[4]。本研究選取尖銳濕疣亞臨床感染患者外生殖器部位典型優(yōu)體皮損進(jìn)行HPV分型，觀察臨床上較為常見的尖銳濕疣亞臨床感染HPV亞型及其與患者預(yù)后相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年4月至2016年12月在梅州市人民醫(yī)院風(fēng)濕皮膚科進(jìn)行初診診斷為典型CA患者158例(典型組)和CA亞臨床感染并且未經(jīng)治療的患者108例(亞臨床組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者醋酸白試驗(yàn)陽性，符合衛(wèi)生部制定的典型尖銳濕疣及亞臨床感染型的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患者在確診前未經(jīng)過任何私自治療；③排除生殖器以及肛周其他感染性疾?。虎芘懦到y(tǒng)性疾病患者。158例典型CA患者中男性102例，女性56例；年齡18～55歲，平均(29.27±8.82)歲；病程6～62 d，平均(29.18±9.97)d?；颊咂p活檢取材位置包括包皮(58例)、陰莖冠狀溝(51例)、大陰唇(29例)以及肛周(20例)。108例CA亞臨床感染患者中男性74例，女性34例；年齡18～51歲，平均(28.54±8.16)歲；病程6～58 d，平均(28.64±10.51)d?；颊咂p活檢取材位置包括包皮(42例)、陰莖冠狀溝(42例)、大陰唇(16例)以及肛周(8例)。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本溶液制備取材范圍為典型尖銳濕疣疣體或者疣體周圍經(jīng)醋酸白試驗(yàn)陽性區(qū)域。在取材過程中應(yīng)該避免所取的標(biāo)本與尖銳濕疣亞臨床期皮損出現(xiàn)交叉污染情況。取材完畢后用生理鹽水將皮損處進(jìn)行反復(fù)沖洗8～10次，以避免出現(xiàn)交叉感染。將所取得的標(biāo)本置入洗脫管中進(jìn)行搗碎，加入蒸餾水后進(jìn)行充分漂洗，取漂洗后的混濁液上離心機(jī)以13 000 r/min進(jìn)行離心10 min，棄上清后加入50 μL裂解液并進(jìn)行吹打混勻，然后將混合液置入水浴箱以100℃溫度進(jìn)行孕育10 min，室溫下冷卻后上離心機(jī)以13 000 r/min進(jìn)行離心10 min，取上清液待用。

1.2.2 HPV基因分型檢測向PCR反應(yīng)管中分別加入5 μL樣品和20 μL緩沖液，以下列條件：50℃，15 min；95℃，10 min；然后以94℃，30 s；42℃，90 s；72℃，30 s進(jìn)行擴(kuò)增，反復(fù)重復(fù)40次以后，在72℃下延伸5 min。然后抽取5 mL加入進(jìn)離心管中，再加入pH值為7.4的SSC和0.1%SDS 5 mL混合A液5 mL，充分振蕩后置入水浴箱中，100℃下加熱10 min后置入雜交箱以51℃下進(jìn)行孵育1 h，然后將膜條轉(zhuǎn)移至pH值為7.4的0.5×SSC和0.1%SDS的B液中，在雜交箱中以51℃下進(jìn)行充分混勻。然后冷卻加入1：2 000的POD溶液在室溫下?lián)u晃30 min，吸取上液后棄掉，再加入混合A液后輕輕震蕩5 min，然后棄掉上清，繼續(xù)重復(fù)此步驟一次。在加入0.4 mol檸檬酸鈉，輕輕振蕩2 min后棄掉。將膜條浸入0.1 mol檸檬酸鈉19 mL，TMB 1 mL和3%的過氧化氫10 μL混合顯色液，置于避光箱中孵育1 h。用蒸餾水對膜條進(jìn)行沖洗，觀察膜條的藍(lán)色斑點(diǎn)位置。觀察藍(lán)色斑點(diǎn)位置，若出現(xiàn)在PC位點(diǎn)則認(rèn)為有效，否則則認(rèn)為實(shí)驗(yàn)污染。最終可測得21種亞型，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種高危亞型和6、11、41、42、44等5種低危亞型。

1.3 研究方法患者在治療后第一個(gè)月每周進(jìn)行復(fù)查一次，確定患者無復(fù)發(fā)現(xiàn)象則改為每兩周復(fù)查一次，期間若發(fā)現(xiàn)新發(fā)尖銳濕疣病灶或者行醋酸白試驗(yàn)陽性亞臨床感染病灶則需要再次手術(shù)。以最后1次手術(shù)結(jié)束為起始觀察6個(gè)月，未發(fā)現(xiàn)新生尖銳濕疣病灶及醋酸白試驗(yàn)陰性者為臨床治愈。將所測的陽性患者HPV基因分型后進(jìn)行分組，擇取同一亞型為一組，了解各組的復(fù)發(fā)情況。

1.4 觀察指標(biāo)分析尖銳濕疣亞臨床感染HPV-DNA類型以及感染情況，并與典型尖銳濕疣進(jìn)行比較。觀察亞臨床感染不同類型HPV出現(xiàn)頑固性復(fù)發(fā)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 典型組和亞臨床組感染HPV-DNA類型及感染情況比較亞臨床組和典型組感染HPV-DNA亞型相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1；不同組別低危型別和高危型別比較差異也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。感染類型相比，典型組尖銳濕疣單一感染率明顯低于亞臨床組，三重以及三重以上感染率明顯高于亞臨床組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而雙重感染兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表1 典型組和亞臨床組感染HPV-DNA類型比較[例(%)]

表2 亞臨床組和典型組尖銳濕疣低危及高危HPV型別比較[例(%)]

表3 亞臨床組和典型組尖銳濕疣HPV感染類型比較[例(%)]

2.2 亞臨床感染不同類型HPV出現(xiàn)頑固性復(fù)發(fā)情況比較所檢出的108個(gè)HPV亞型中，復(fù)發(fā)次數(shù)高達(dá)3次以及3次以上的患者共14例，占13.0%，包括HPV16+18型4例、HPV16+52型3例、HPV16型3例、HPV18型2例、HPV6+11型1例、HPV43型1例。出現(xiàn)頑固性復(fù)發(fā)的HPV類型所占比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.521，P＞0.05)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)對人類有致病作用的HPV有40余種，不同的亞型導(dǎo)致患者出現(xiàn)癥狀不一。一般來說，尖銳濕疣引起患者感染多數(shù)為亞臨床感染狀態(tài)，多發(fā)生于外陰處。而當(dāng)出現(xiàn)典型臨床癥狀后，疣體可便發(fā)生于外陰和肛門任何地方。

在所有感染中，以HPV 6型和11型最為常見[5]。根據(jù)致癌的風(fēng)險(xiǎn)一般將其分為低危型和高危型。其中低危型主要包括HPV 6、11、40、42、43、44、55、61、81、83，其中以HPV 6、11最為常見，為尖銳濕疣的主要病原。高危型主要包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、26、53、68、82、73、53，其中以HPV16、18最為常見，其為宮頸癌發(fā)病的主要罹患因素[6]。國內(nèi)同樣有研究發(fā)現(xiàn)，低危型是目前國內(nèi)主要的感染類型[7]。臨床上治療尖銳濕疣的方法較多，雖然在治療當(dāng)時(shí)效果明顯，但是不少患者仍然會(huì)出現(xiàn)不同程度的復(fù)發(fā)情況，甚至復(fù)發(fā)三次及三次以上的頑固性復(fù)發(fā)，原因至今不明。有研究認(rèn)為HPV復(fù)發(fā)與患者體內(nèi)的性激素水平具有相關(guān)性[8]。但也有研究認(rèn)為，復(fù)發(fā)和患者激素水平并無相關(guān)性，可能是由于HPV感染真皮層細(xì)胞所致[9]。楊慶永等[10]則認(rèn)為，尖銳濕疣復(fù)發(fā)可能與亞臨床感染具有一定的關(guān)系。

本研究擇取的亞臨床感染患者中，HPV 6型所占比例最高，為50.9%，HPV 11型和16型其次，分別占16.7%和13.0%。說明亞臨床感染主要為HPV 6型，與相關(guān)研究一致。但本研究還發(fā)現(xiàn)HPV 56型感染有10例，而此類型以往鮮有相關(guān)報(bào)道。究竟此類型是否與尖銳濕疣亞臨床期發(fā)生有關(guān)，目前并無相關(guān)報(bào)道，需進(jìn)一步進(jìn)行研究。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在HPV亞臨床感染患者中，低危型占79.6%，是主要的感染危型。并且其占比例與典型HPV感染差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明HPV感染均以低危型感染為主。本研究對頑固性復(fù)發(fā)的HPV亞型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，HPV16和18型是最常見的復(fù)發(fā)類型，而這兩者為高危型，提示高危型是影響患者預(yù)后的因素，但如要進(jìn)一步了解是否具有相關(guān)性則需要通過對更大樣本的研究。

綜上所述，尖銳濕疣亞臨床感染主要亞型為HPV 6型，并以單一感染為主，多種感染者復(fù)發(fā)率較高，應(yīng)該引起臨床重視。

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