侯蘊(yùn)祈， 石海琴， 楊紅姬

在中國(guó)癲癇發(fā)病人數(shù)近千萬(wàn)，需要長(zhǎng)期服用抗癲癇藥物，包括新舊抗癲癇藥物，臨床上廣泛應(yīng)用于癲癇、神經(jīng)痛、精神性疾病等方面，大部分為芳香族(aromatic antiepileptic drugs,AEDs)，該類藥物因具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)并均攜帶苯環(huán)，最常見(jiàn)的不良反應(yīng)是引起皮疹，目前多觀點(diǎn)認(rèn)為，AEDs在身體經(jīng)酶代謝后與蛋白多肽形成半抗原復(fù)合物，誘發(fā)后來(lái)的過(guò)敏反應(yīng)[1]。引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)在不同人種、不同民族、地緣遠(yuǎn)近地區(qū)中也有所不同。這說(shuō)明過(guò)敏反應(yīng)可能與基因相關(guān)，有研究顯示中國(guó)臺(tái)灣和香港地區(qū)癲癇患者應(yīng)用CBZ引致的SJS、TEN和HLA-B*1502有較強(qiáng)的相關(guān)性[2]。在中國(guó)漢族人群中，8%～15%或更多的人可能是HLA-B*1502陽(yáng)性基因型[3]。目前該基因與所有的AEDs的相關(guān)性尚不確定，需要臨床研究提供進(jìn)一步的證據(jù)[4]。如能明確HLA-B*1502陽(yáng)性基因型是AEDs致敏的必要條件，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥有很大意義，本研究通過(guò)對(duì)AEDs致敏性和HLA-B*1502關(guān)系進(jìn)行分析，探尋HLA-B*1502是否可以作為潛在的靶點(diǎn)蛋白，以求為患者預(yù)后的判斷提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2014年1月1日-2017年6月31日我院門(mén)診與住院部及廣州醫(yī)科大學(xué)附屬二院神經(jīng)科學(xué)研究所AEDs致敏性患者75例資料。均為AEDs誘導(dǎo)皮膚不良反應(yīng)的患者，男性35例，女性40例，診斷為AEDs致敏性，平均年齡為(5.94±1.85)歲。病例隨訪中，最短的隨訪14個(gè)月，最長(zhǎng)的58個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為45個(gè)月，其中單藥致敏組36例，男性18例，女性18例，平均年齡為(5.71±1.96)歲；多藥致敏組39例，男性17例，女性22例，平均年齡為(5.99±1.85)歲；輕型藥疹組40例，男性20例，女性20例，平均年齡為(5.75±1.85)歲；抗癲癇藥物高敏綜合征組35例，男性15例，女性20例，平均年齡為(5.98±1.75)歲；同時(shí)納入健康對(duì)照組60例，男性31例，女性29例，平均年齡為(5.75±1.79)歲；組間年齡、性別無(wú)顯著差異。

1.2 方法 RNA提取及RT-PCR反應(yīng)：采集入組患者和正常志愿者靜脈血，EDTA抗凝管收集后用德國(guó)QIAGEN公司DNA抽提試劑測(cè)定DNA純度和濃度，調(diào)至30 μg/ml在-40 ℃保存。順序特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(sequence spcific primers，PCR-SSP):設(shè)計(jì)6對(duì)特異性引物(分別為S1、S2、S3、S4/s5、s6)及兩對(duì)內(nèi)參引物(C1、C2)。25 μl PCR反應(yīng)體系：DNA50 ng，dNTPs 200 μmol/L，Taq聚合酶0.05 U/μl,各引物終濃度為1 μmol/L,反應(yīng)緩沖液終濃度為1×PCP緩沖液。PCR反應(yīng)：擴(kuò)增熱循環(huán)：96 ℃預(yù)變性60 s,96 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,2 ℃延伸45 s,4個(gè)循環(huán)，96 ℃變性10 s,58 ℃退火10 s,72 ℃延伸45 s,21個(gè)循環(huán)，96 ℃變性10 s,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸90 s,9個(gè)循環(huán)。 2.0%凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)熒光成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，精確概率法、卡方檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行分析，相關(guān)性檢驗(yàn)通過(guò)Pearson相關(guān)分析，數(shù)據(jù)分析以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AEDs致敏性組織中HLA-B*1502表達(dá) AEDs致敏性組HLA-B*1502表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。分析AEDs致敏性患者病例中HLA-B*1502表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HLA-B*1502表達(dá)在患者年齡、性別等方面無(wú)顯著性差異(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 AEDs致敏性組織中HLA-B*1502的表達(dá)與致敏藥物的數(shù)量相關(guān)性分析 多藥致敏組HLA-B*1502基因陽(yáng)性表達(dá)高于單藥致敏組；抗癲癇藥物高敏綜合征組HLA-B*1502基因陽(yáng)性表達(dá)高于輕型藥疹組，HLA-B*1502表達(dá)水平越高，致敏藥物越多(見(jiàn)表2、圖1)。

表1 患者的血液標(biāo)本中HLA-B*1502表達(dá)情況

與健康對(duì)照組比較#P<0.05

表2 AEDs致敏性HLA-B*1502的表達(dá)與致敏藥物的數(shù)量、皮膚不良反應(yīng)的臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度情況

多藥致敏組與單藥致敏組比較#P<0.05；抗癲癇藥高敏綜合征組與輕型藥疹組比較*P<0.05

圖1 HLA-B*1502表達(dá)水平與致敏藥物數(shù)量相關(guān)性分析

3 討 論

癲癇是小兒與成人神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球平均每年每10萬(wàn)人就有50例新發(fā)病例，總共約有5000萬(wàn)癲癇患者，其中又以兒童及青少年居多，常常影響患兒的神經(jīng)生理發(fā)育及生活質(zhì)量[5]。目前口服抗癲癇藥物仍是臨床上治療的主要方法，包括新舊抗癲癇藥物，簡(jiǎn)稱AED，臨床上廣泛應(yīng)用于癲癇、神經(jīng)痛、精神性疾病等方面，大部分為AEDs，該類藥物最常見(jiàn)的不良反應(yīng)是引起皮疹，輕者為斑疹、丘疹或斑丘疹(MPE)，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)超敏綜合征(HSS)、史蒂文斯-約翰綜合征(SJS)或中毒性表皮松解壞死(TEN)等，表現(xiàn)為皮膚水泡樣皮疹，皮膚脫落，累及皮膚黏膜、內(nèi)臟軀干及四肢，整體皮膚表面積分離，致死率高達(dá)40%[6～8]。臨床常用的芳香族抗癲癇藥物主要包括卡馬西平、奧卡西平、拉莫三嗪、苯妥英鈉、苯巴比妥等，可有新近研究也提示非芳香族抗癲癇藥也可誘導(dǎo)機(jī)體高敏反應(yīng)。雖然由AEDs誘發(fā)的嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)發(fā)病率較低，但是因其嚴(yán)重威脅患者的生命和用藥安全，越來(lái)越受到相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者的重視[9]。

目前認(rèn)為藥疹的發(fā)生是一種免疫應(yīng)答反應(yīng)，目前多觀點(diǎn)認(rèn)為，AEDs在身體經(jīng)酶代謝后與蛋白多肽形成半抗原復(fù)合物，誘發(fā)后來(lái)的過(guò)敏反應(yīng)。引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)在不同人種、不同民族、地緣遠(yuǎn)近地區(qū)中也有所不同[10]。這說(shuō)明過(guò)敏反應(yīng)可能與基因相關(guān)，而近年來(lái)的研究報(bào)道指向AEDs致敏反應(yīng)與HLA等位基因具相關(guān)性，而且該基因在中國(guó)人群中比例較高。HLA是人類基因調(diào)控人體免疫應(yīng)答特異性及影響個(gè)體疾病易感性差異的主要多態(tài)性系統(tǒng)，有研究表明，HLA-B*1502基因與CBZ引起的SJS、TEN密切相關(guān)，且mRNA表達(dá)水平顯著高于耐受組[11]。有研究顯示中國(guó)臺(tái)灣和香港地區(qū)癲癇患者應(yīng)用CBZ引致的SJS、TEN和HLA-B*1502有較強(qiáng)的相關(guān)性[12]。在中國(guó)漢族人群中，8%～15%或更多的人可能是HLA-B*1502陽(yáng)性基因型。目前該基因與所有的AEDs的相關(guān)性尚不確定，需要臨床研究提供進(jìn)一步的證據(jù)[13]。目前大陸地區(qū)相關(guān)方面的臨床研究少見(jiàn)報(bào)道，且已有報(bào)道樣本尚少，佛山地區(qū)尚缺乏相關(guān)地區(qū)的基因篩查及流行病學(xué)調(diào)查[14]，本課題就是進(jìn)一步研究我地區(qū)AEDs引起的過(guò)敏反應(yīng)是否和HLA-B*1502基因相關(guān)，如能明確HLA-B*1502陽(yáng)性基因型是AEDs致敏的必要條件，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥有很大意義，可以在長(zhǎng)期服藥前進(jìn)行基因篩查，避免致敏的可能，減少病患的痛苦及減輕不必要的醫(yī)療支出。

在本研究中，我們通過(guò)對(duì)75例AEDs致敏性組織HLA-B*1502的陽(yáng)性表達(dá)情況，分析致敏藥物的數(shù)量、皮膚不良反應(yīng)不同與HLA-B*1502基因表達(dá)的差異性，結(jié)果顯示，在AEDs致敏組中陽(yáng)性表達(dá)要遠(yuǎn)高于陰性表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與王蕊艷等[15]研究結(jié)論相似。結(jié)果表明HLA-B*1502表達(dá)陽(yáng)性率增高與AEDs致敏性的發(fā)生可能有密切的關(guān)系。目前國(guó)內(nèi)外研究顯示，常見(jiàn)的芳香族類AEDs包括多個(gè)種類，芳香族類AEDs的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有芳香環(huán)，氧化代謝產(chǎn)生含有芳香環(huán)的中間產(chǎn)物，在細(xì)胞色素P450酶的作用下，該中間產(chǎn)物在環(huán)氧化物羥化酶的作用下生成能溶于水的代謝產(chǎn)物，當(dāng)肝臟環(huán)氧化物羥化酶缺乏或功能缺陷時(shí)，經(jīng)腎臟排出體外，芳香類氧化物大量堆積，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，結(jié)合形成大分子物質(zhì)，同時(shí)激活特異性T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)皮膚不良反應(yīng)的發(fā)生，啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)，因此芳香族類AEDs誘發(fā)皮膚不良反應(yīng)的發(fā)生率較高[16]。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS) 被越來(lái)越多地應(yīng)用于遺傳異質(zhì)性的研究中，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，遺傳異質(zhì)性與人類白細(xì)胞抗原(human leukocytes antigen,HLA)基因密切相關(guān)[17]。已有研究證實(shí)了，AEDs致敏導(dǎo)致的皮膚不良反應(yīng)與HLA-B*1502基因型有關(guān)[18]。既往研究?jī)H分析AEDs所致皮膚不良反應(yīng)與HLA-B*1502等位基因的相關(guān)性。但并未對(duì)比輕型藥疹與重癥藥疹、多藥致敏與單藥致敏之間HLA-B*1502等位基因表達(dá)的差異。本研究分析了HLA-B*1502的表達(dá)與AEDs致敏性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)且多藥致敏組HLA-B*1502基因陽(yáng)性表達(dá)高于單藥致敏組，抗癲癇藥物高敏綜合征組HLA-B*1502基因陽(yáng)性表達(dá)高于輕型藥疹組，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HLA-B*1502表達(dá)越高致敏藥物數(shù)量越多。

本研究未收集HLA-B*1502的表達(dá)與AEDs致敏性預(yù)后的影響，因此我們將在之后的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，詳細(xì)收集AEDs致敏性藥物干預(yù)對(duì)AEDs致敏性預(yù)后的影響，分析HLA-B*1502的表達(dá)在藥物治療效果的差異性和耐藥性中的作用。綜上所述，HLA-B*1502在AEDs致敏性的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，HLA-B*1502可能成為AEDs致敏性的治療的新靶點(diǎn)，對(duì)AEDs致敏性診斷及預(yù)后有重要的價(jià)值。

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