李夢楠， 馬振凱， 白宏英

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是目前最常見的神經(jīng)退行性疾病，嚴重影響中老年人運動功能。線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、神經(jīng)興奮性改變、神經(jīng)炎性反應(yīng)和蛋白異常聚集等多種因素推動著PD的發(fā)生與發(fā)展。其中，神經(jīng)炎性反應(yīng)已經(jīng)逐漸成為研究熱點。小膠質(zhì)細胞是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中自身免疫調(diào)節(jié)細胞，占整個膠質(zhì)細胞總數(shù)的20%，對維持神經(jīng)元的生存起著重要作用。抑制小膠質(zhì)細胞的過度激活及炎癥反應(yīng)從而減弱神經(jīng)元變性是一種新的治療方向。RO是一種強烈的神經(jīng)毒性劑，已被廣泛用于制作PD疾病動物和細胞模型。RO可通過加重線粒體損傷，促進氧化應(yīng)激、凋亡以及活化小膠質(zhì)細胞等方面造成神經(jīng)毒性反應(yīng)[1]，而Cur是一種從姜黃的根莖中提取出來的一種脂溶性酚類色素，具有抗炎、抗氧化、抗斑塊及清除氧自由基等多種藥理反應(yīng)。前期研究主要集中在Cur對神經(jīng)元細胞的保護作用，發(fā)現(xiàn)它可通過清除細胞內(nèi)ROS，誘導細胞內(nèi)蛋白酶體水解酶活性以及過表達熱休克蛋白Hsp70等方面拮抗RO誘導的神經(jīng)元細胞損傷。而本研究主要集中探索Cur能否減弱RO誘導的小膠質(zhì)細胞激活和細胞損傷。

研究證實小鼠小膠質(zhì)細胞系BV2細胞與原代小膠質(zhì)細胞具有相類似的生物學功能，并已經(jīng)廣泛用于體外小膠質(zhì)細胞模型[2，3]。SH-SY5Y細胞具有多巴胺神經(jīng)元的諸多特征，被廣泛用于體外神經(jīng)元樣細胞模型。本實驗在觀察Cur是否減弱RO介導的BV2細胞晚期終末糖基化受體/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(RAGE/NF-κB)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，并收集不同組的BV2條件培養(yǎng)液(conditioned media,CM)培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，評估姜黃素對于神經(jīng)細胞活力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液PBS購自美國HyClone公司；姜黃素、魚藤酮購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司；兔抗小鼠RAGE、NF-κB單克隆抗體購自美國Sigma公司；HRP標記羊抗兔二抗購自美國Zymed公司；MPO、ICAM、TNF-α、iNOS的ELISA檢測試劑盒購于美國R&D公司；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific公司；-80 ℃冰箱(美國Thermo公司)；多波長酶標儀(美國Bio-TEK公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 小鼠小膠質(zhì)細胞BV2細胞株和SH-SY5Y細胞株均購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學細胞中心。用10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，將細胞置于5%CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，2～3 d后傳代。至細胞鋪滿底部70%～80%時消化處理并接受不同干預(yù)處理。SH-SY5Y細胞用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，隔天換液一次，并取處于對數(shù)生長期的細胞消化處理。

1.3 藥物處理和細胞分組 Cur溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，并配制成20 mmol/L的儲存液，-20 ℃儲存，待用時用完全培養(yǎng)基進行稀釋成工作液；RO溶解于DMSO，配制成1 mmol/L的儲存液，-20 ℃儲存，并同樣用完全培養(yǎng)基稀釋成工作液。分組為：空白對照組：不施加干預(yù)因素；RO組：處理濃度為10 nmol/L，作用時間6 h；Cur干預(yù)組：預(yù)先用RO處理后，加入濃度1、5、10 μmol/L Cur共同孵育4 h。收集各組細胞。每組實驗重復(fù)3次。CM處理SH-SY5Y細胞：收集上述各培養(yǎng)組的上清液，作為SH-SY5Y細胞的CM。每次實驗前需重新更換SH-SY5Y細胞的培養(yǎng)基，將CM加入SH-SY5Y細胞繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集細胞觀察其存活率。

1.4 Western blot檢測各組細胞RAGE/NF-κB表達 收集各組細胞并用裂解液于冰上收集總蛋白，BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度后調(diào)整每孔濃度為50 μg。上樣緩沖液按相應(yīng)比例與總蛋白液混勻后100 ℃，5 min煮沸變性。先后按照80 V 40 min和120 V 90 min的條件進行SDS-PAGE凝膠電泳和PVDF轉(zhuǎn)膜。封閉洗脫后，兔抗RAGE抗體1∶1000，兔抗NF-κB抗體1∶2000，兔多克隆GAPDH 抗體1∶1000 4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗(稀釋比例1∶5000)室溫下孵育2 h。洗膜后在暗室進行ECL顯影，用圖像分析軟件Quantity One分析條帶的目的蛋白和內(nèi)參蛋白的積分光密度值。

1.5 ELISA法測定上清液炎癥反應(yīng)性介質(zhì)含量 收集各組上清液200 μl，按照細胞間粘附分子-1 (ICAM)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的ELISA檢測試劑盒說明書處理?？瞻卓渍{(diào)零后測定450 nm波長處各孔的吸光度，并繪制標準曲線。根據(jù)樣品孔中的吸光光度值計算出相應(yīng)的細胞因子的含量。

1.6 MTT比色法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后離心，并用培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，反復(fù)吹打制成單個細胞懸液，計數(shù)后將細胞濃度調(diào)整為1×108～1×109/L，按1×104～1×105個/孔(90 μl/孔)接種于96孔培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個復(fù)孔。調(diào)零孔中只加入同體積的培養(yǎng)基，并不接種細胞。向每孔中加入10 μl MTT (5 mg/ml)，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，加入100 μl DMSO，震蕩10 min至甲臜顆粒完全溶解，酶標儀570 nm波長處測定各孔OD值。

2 結(jié) 果

2.1 Cur對BV2細胞活力的影響 首先檢測各組細胞在不同濃度Cur干預(yù)下的活力的變化以研究它對BV2細胞的毒性作用。結(jié)果顯示不同濃度Cur(0～10 μmol/L)干預(yù)后并未對細胞活力造成影響，各組間并無顯著性差異(見圖1)。

2.2 Cur對RO刺激的BV2細胞的RAGE/NF-κB表達 采用Western blot分析BV2細胞中RAGE/NF-κB 的表達情況。與空白對照組相比，RO組RAGE和NF-κB的蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)；與RO組相比，Cur干預(yù)組(1、5、10 μmol/L)能夠明顯降低細胞內(nèi)RAGE和NF-κB的含量(P<0.05)。其中，對于NF-κB的抑制作用是隨著Cur濃度升高而更加顯著。具體的灰度值數(shù)據(jù)(見表1)，條帶圖(見圖2)。

2.3 Cur對RO刺激的BV2細胞分泌ICAM、TNF-α和iNOS的影響 細胞經(jīng)過RO(10 nmol/L)及Cur(1、5、10 μmol/L)處理后，收集各培養(yǎng)組上清液進行ELISA檢測各個細胞因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，RO組ICAM、TNF-α和iNOS的表達明顯升高，ICAM、TNF-α和iNOS分別是其的3.13倍、20倍和4倍。與RO組相比，Cur干預(yù)組能明顯減弱ICAM、TNF-α和iNOS的分泌量，且抑制效應(yīng)隨著Cur濃度的增加更加增強。具體的數(shù)據(jù)(見表2)。

2.4 CM對SH-SY5Y細胞增殖活力的影響 收集BV2細胞各處理組的上清液，作為SH-SY5Y細胞的CM。作用24 h測定細胞活力。結(jié)果提示，與空白對照組相比，RO組細胞活力顯著降低(P<0.01)；與魚藤組相比，Cur處理組細胞活力明顯升高，且隨著Cur劑量的升高細胞活力呈明顯升高趨勢(P<0.05)。具體數(shù)據(jù)(見圖3)。

表1 Cur對RO刺激的BV2細胞RAGE/NF-κB蛋白表達的影響

與空白對照組相比#P<0.01；與RO組相比*P<0.05，**P<0.01

表2 Cur對RO刺激BV2細胞ICAM、TNF-α和iNOS的影響

與空白對照組相比#P<0.01；與RO組相比*P<0.05，**P<0.01

圖1 MTT法檢測不同濃度Cur對BV2細胞活力的影響

Cur1：1.0 μmol/L Cur干預(yù)組；Cur5：5 μmol/LCur干預(yù)組；Cur10：10 μmol/L Cur干預(yù)組。與空白對照組相比#P<0.01；與RO組相比*P<0.05，**P<0.01

圖2 RAGE/NF-κB的蛋白條帶圖

與空白對照組相比#P<0.01；與RO組相比*P<0.05，**P<0.01

圖3 MTT法檢測不同處理組CM對SH-SY5Y細胞活力的影響

3 討 論

作為一種神經(jīng)變性疾病，PD以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失為特征，炎癥反應(yīng)是神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的重要特征。其中，小膠質(zhì)細胞在調(diào)節(jié)中樞系統(tǒng)免疫反應(yīng)中起著重要作用。PD患者病理尸檢中就發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元周圍聚集的大量活化的小膠質(zhì)細胞[4]，而對原發(fā)性和家族性PD患者的腦組織切片病理也發(fā)現(xiàn)大量反應(yīng)性小膠質(zhì)細胞[5]。它在靜息狀態(tài)下起著免疫監(jiān)視作用；適度活化后，通過吞噬病原體，有害顆粒以及死亡神經(jīng)細胞并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和基質(zhì)分子等功能來修復(fù)受損神經(jīng)元；但持續(xù)活化會釋放一系列潛在的神經(jīng)毒性分子和炎癥介質(zhì)如：NO、O2-、IL-1β和TNF-α，加重細胞毒性反應(yīng)導致繼發(fā)性腦組織損傷[6,7]。

RAGE受體廣泛表達于多種細胞，其中包括神經(jīng)元細胞，并能感知包括晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)在內(nèi)的多種信號分子。實際上，大多數(shù)RAGE的配體都參與免疫炎癥和細胞遷移過程，而在炎癥反應(yīng)中RAGE的表達也是上調(diào)的。但異常過度的RAGE表達和活化會導致細胞產(chǎn)生過強的免疫反應(yīng)，這種病理過程參與了人類很多疾病的發(fā)生與發(fā)展，如：缺血性損傷、阿爾茲海默病等。因此，阻斷RAGE相關(guān)信號通路具有極大的治療潛力。越來越多的證據(jù)表明，PD患者腦內(nèi)路易斯小體中存在積聚的AGEs是導致患者呈現(xiàn)亞臨床狀態(tài)的主要原因。

多項研究表明RAGE的內(nèi)源性信號通路控制著與很多疾病相關(guān)的病理生理過程。已證明作為核轉(zhuǎn)錄因子的NF-κB是第一個發(fā)現(xiàn)由AGEs活化并產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導分子，而且NF-κB錨定在細胞核上可以進一步正反饋升高RAGE mRNA的轉(zhuǎn)錄[8]。作為一種炎癥反應(yīng)過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NF-κB刺激多種炎癥介質(zhì)的釋放，例如：環(huán)加氧化酶-2(COX-2)、TNF-α、白介素-6/1β(IL-6、IL-1β)[9]等。此外，由iNOS介導生成的NO和由此形成的ROS也被RAGE/NF-κB操控[10]。體外實驗表明RO能增加大鼠NF-κB的表達[11]，類似的RO能通過降解小膠質(zhì)細胞中抑制蛋白κB(IκB)來活化NF-κB[12]。

前期研究已經(jīng)表明0～20 nmol/L的RO并未影響B(tài)V2細胞的活力，因此本實驗將RO濃度設(shè)定為10 nmol/L，即在不影響細胞活力的前提下探索RO對小膠質(zhì)細胞的炎性反應(yīng)及Cur的保護作用。首先我們的研究涉及探索設(shè)定的Cur濃度范圍(1～10 μmol/L)是否對BV2細胞造成毒性，MTT結(jié)果顯示，在此濃度范圍內(nèi)BV2細胞活力并未受到影響。于是，我們采用Western blot分析BV2細胞內(nèi)RAGE/NF-κB表達，發(fā)現(xiàn)RO能明顯升高細胞體內(nèi)RAGE和NF-κB的蛋白表達，但是這種升高作用能被Cur所減弱，且隨著濃度的升高這種減弱作用也逐漸增強。緊接著，我們開始檢測NF-κB下游的各種炎癥因子的變化。同樣的，這些炎癥介質(zhì)在RO的刺激下過量表達，但Cur也能抑制這些下游信號分子的分泌，并且也呈現(xiàn)濃度依賴性。PD疾病模型中過強且紊亂的炎癥反應(yīng)會導致神經(jīng)元細胞的損傷，如果Cur能在一定程度上清除RO介導的炎癥介質(zhì)，那收集BV2細胞的上清液作為CM培養(yǎng)神經(jīng)細胞，觀察是否Cur降低炎癥介質(zhì)后同樣會減弱RO所致的細胞損傷 。MTT結(jié)果顯示，Cur同樣能在一定程度上扭轉(zhuǎn)RO介導的神經(jīng)元損傷并增強細胞活力。RAGE活化刺激下游信號分子MAPK瀑布增強炎癥反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB的表達[13]，從而加重RO介導的中樞神經(jīng)元損傷。此外，Hernandez-Romero[14]的研究證實，NF-κB和下游信號分子TNF-α，ICAM和iNOS能在RO刺激下明顯升高，這進一步驗證我們的研究。

總之，本研究證實Cur可通過抑制RAGE/NF-κB和下游炎癥反應(yīng)發(fā)揮對多巴胺能神經(jīng)細胞的保護效應(yīng)。

[1]韓 威,孫立忠,胡林森.魚藤酮與帕金森病[J].中國老年學雜志,2011,31(12):2376-2378.

[2]Song JH,Marszalec W,Kai L,et al.Antidepressants inhibit proton currents and tumor necrosis factor-α production in BV2 microglial cells[J].Brain Research,2012,1435(1435):15-23.

[3]Jin M,Kim B W,Koppula S,et al.Molecular effects of activated BV-2 microglia by mitochondrial toxin 1-methyl-4-phenylpyridinium[J].Neurotoxicology,2012,33(2):147-155.

[4]Mcgeer PL,Itagaki S,Tago H,et al.Reactive microglia in patients with senile dementia of the Alzheimer type are positive for the histocompatibility glycoprotein HLA-DR[J].Neuroscience Letters,1987,79(1/2):195.

[5]Chen X,Zhang N,Li C,et al.Parallel relationship between microglial activation and substantial nigra damage in rotenone-induced Parkinson's disease rat model[J].Neural Regen Res,2010,5(4):245-250.

[6]Heales SJR,Lam AAJ,Duncan AJ,et al.Neurodegeneration or neuroprotection:the pivotal role of astrocytes[J].Neurochemical Research,2004,29(3):513.

[7]Davalos D,Grutzendler J,Yang G,et al.ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo[J].Nature Neuroscience,2005,8(6):752.

[8]Li J,Schmidt AM.Characterization and functional analysis of the promoter of RAGE,the receptor for advanced glycation end products[J].Journal of Biological Chemistry,1997,272(26):16498-506.

[9]Wegener E,Krappmann D.Dynamic protein complexes regulate NF-κB signaling[M]//Protein-protein interactions as new drug targets.Springer berlin heidelberg,2008.237-259.

[10]Vallance P,Leiper J.Blocking NO synthesis:how,where and why[J].Nature Reviews Drug Discovery,2002,1(12):939.

[11]Thakur P,Nehru B.Inhibition of neuroinflammation and mitochondrial dysfunctions by carbenoxolone in the rotenone model of Parkinson’s disease[J].Molecular Neurobiology,2015,51(1):209-219.

[12]Wilms H,Zecca L,Rosenstiel P,et al.Inflammation in Parkinson's diseases and other neurodegenerative diseases:cause and therapeutic implications[J].Current Pharmaceutical Design,2007,13(18):1925-1928.

[13]Lander HM,Tauras JM,Ogiste JS,et al.Activation of the receptor for advanced glycation end products triggers a p21(ras)-dependent mitogen-activated protein kinase pathway regulated by oxidant stress[J].Journal of Biological Chemistry,1997,272(28):17810.

[14]Hernandez-Romero MC,Delgado-Cortes MJ,Sarmiento M,et al.Peripheral inflammation increases the deleterious effect of CNS inflammation on the nigrostriatal dopaminergic system[J].Neurotoxicology,2012,33(3):347-360.